孕酮對新生鼠腦室周圍白質(zhì)軟化模型腦白質(zhì)少突細胞標記物O1和O4表達的影響

雷賢明 楊 潔 曹云濤

遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院新生兒科（貴州遵義 563000）

孕酮對新生鼠腦室周圍白質(zhì)軟化模型腦白質(zhì)少突細胞標記物O1和O4表達的影響

雷賢明 楊 潔 曹云濤

遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院新生兒科（貴州遵義 563000）

目的探討孕酮對新生鼠腦室周圍白質(zhì)軟化（PVL）動物模型腦室周圍白質(zhì)O1和O4表達的影響。方法2日齡新生SD大鼠隨機分為模型組、實驗組、假手術組。模型組和實驗組結扎左側頸總動脈并吸入低氧氣源（8%O2+92%N2）0.5 h制備PVL動物模型，實驗組腦缺氧缺血后立即腹腔注射孕酮 10 mg/(kg·d)；假手術組只分離左側頸總動脈不結扎、不缺氧。術后1、4、7、14天比較三組腦組織病理改變，免疫組織化學染色方法檢測三組大鼠各個時點腦室旁白質(zhì)區(qū)O1、O4表達。結果

孕酮； 腦室周圍白質(zhì)軟化； 少突細胞標記物O4； 少突細胞標記物O1； 新生大鼠

隨著新生兒重癥監(jiān)護病房（NICU）救治水平的提升，極低出生體質(zhì)量兒、超低出生體質(zhì)量兒的存活率提高，早產(chǎn)兒腦損傷發(fā)病率也逐漸增加。腦室周圍白質(zhì)軟化（periventricular leukomalacia，PVL）是早產(chǎn)兒腦損傷的主要形式，是導致早產(chǎn)兒神經(jīng)發(fā)育、行為障礙及腦癱的主要原因[1]。PVL發(fā)病與腦缺氧缺血關系密切。本實驗通過腦缺氧缺血制備新生大鼠腦室周圍白質(zhì)軟化模型，早期給予孕酮干預，觀察新生大鼠腦室周圍白質(zhì)病理改變及晚期少突膠質(zhì)細胞前體標記物O1（oligodendrocyte marker O1）和O4的表達變化，探討孕酮對新生大鼠腦室周圍白質(zhì)軟化動物模型的神經(jīng)保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

2日齡清潔級SD大鼠，體質(zhì)量（7.65±0.12）g，雌雄不拘。親代雌鼠及雄鼠購買于第三軍醫(yī)大學醫(yī)學實驗動物中心，編號：scxk（渝）2012-0005。納入實驗動物120只，每組40只，保證各時點有8只大鼠成功造模。實驗中共死亡大鼠25只，死亡大鼠另行補充。

將新生SD大鼠隨機分為模型組、實驗組及假手術組。模型制備參照Taniguchi等[2,3]大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，分離并結扎左側頸總動脈，術后室溫中恢復1 小時，隨后吸入8%O2+92%N2低氧混合氣體0.5小時。假手術組只分離左側頸總動脈，不結扎、不缺氧；給藥參照Li等[4]模型組及假手術組腹腔注射芝麻油0.1 mL，實驗組腹腔注射0.5 g/L的孕酮溶液10 mg/kg，間隔24小時1次，連續(xù)3次，用藥完畢后送回母鼠身邊喂養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 腦組織病理切片制備 三組大鼠于術后1、4、7、14天各取8只，4%多聚甲醛穿心注射處死，制作腦組織標本，進行石蠟包埋切片和蘇木精-伊紅（HE） 染色。腦組織自丘腦中1/3平面開始連續(xù)冠狀切片，片厚4μm，切面包括腦室、胼胝體、腦室周圍白質(zhì)等部位，常規(guī)HE染色觀察三組腦室周圍白質(zhì)病理改變。

1.2.2 腦室周圍白質(zhì)O4和O1表達檢測 經(jīng)丘腦中1/3平面開始連續(xù)冠狀切片，通過免疫組織化學法(SP染色)檢測腦室周圍白質(zhì)O1和O4的表達，操作按說明書進行。一抗（兔來源，O1稀釋度1:100，O4稀釋度1:100，均購買于R＆D USA），二抗（羊抗兔抗體，均購買于上?；蚩萍加邢薰荆1、O4染色均以細胞膜著色呈黃色或棕色為陽性細胞。每只大鼠隨機選取3張切片，在400倍光鏡下隨機選取腦室周圍白質(zhì)3個檢測面積相同的陽性細胞區(qū)域由Image-Pro Plus 6.0細胞圖像分析軟件完成圖像采集并處理數(shù)據(jù)。1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t法；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組新生鼠的一般情況

模型組、實驗組新生大鼠結扎左側頸總動脈后出現(xiàn)不同程度的發(fā)紺、皮膚蒼白、呼吸減慢；在缺氧艙中缺氧期間，新生大鼠表現(xiàn)為煩躁不安，時有陣發(fā)性點頭狀、上肢屈曲及下肢伸直狀抖動，全身皮膚蒼白、青紫，缺氧結束后10～30 min，皮膚青紫逐漸好轉(zhuǎn)，其他癥狀均于術后1天內(nèi)消失，實驗中模型組和實驗組大鼠共死亡25只。假手術組無青紫、皮膚蒼白、煩躁及四肢抖動等癥狀。

2.2 三組新生鼠腦組織病理改變

假手術組在術后各時間點腦室周圍白質(zhì)區(qū)細胞排列整齊，結構完整，雙側腦室對稱。術后1天模型組及實驗組大鼠均出現(xiàn)腦室周圍白質(zhì)神經(jīng)細胞稀疏、水腫、排列紊亂；術后4天模型組腦室周圍白質(zhì)區(qū)組織結構疏松明顯，出現(xiàn)細胞水腫、壞死、核固縮，小膠質(zhì)細胞較多；術后7天模型組腦室周圍白質(zhì)區(qū)有液化性壞死，有篩孔狀壞死灶及囊腔形成，左側側腦室稍擴大；術后14天模型組左側側腦室進一步擴大，腦室周圍出現(xiàn)軟化灶，白質(zhì)區(qū)出現(xiàn)新生血管、膠質(zhì)細胞增生；術后4、7、14天實驗組腦室周圍白質(zhì)病變與模型組病理改變相似，但較輕，新生血管、膠質(zhì)細胞增生明顯。見圖1。

2.3 三組新生大鼠腦室旁白質(zhì)區(qū)O4表達變化

三組大鼠在術后不同時間點（1、4、7和14天）腦室旁白質(zhì)區(qū)O4陽性細胞的IOD值差異有統(tǒng)計學意義（F= 220.37～500.29，P均＜0.001）；術后1、4、7天腦室旁白質(zhì)區(qū)O4陽性細胞IOD值逐漸增加，術后7天達高峰，術后14天較7天明顯下降。在不同時間點，三組大鼠之間O4陽性細胞的IOD值差異有統(tǒng)計學意義（F=341.53～624.33，P均＜0.001）；在各個時間點，模型組與實驗組O4陽性細胞的積分光密度（IOD）值均較假手術組低，模型組更低于實驗組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1、圖2。

2.4 三組新生大鼠腦室旁白質(zhì)區(qū)O1表達變化

三組大鼠在術后不同時間點（1、4、7和14天）腦室旁白質(zhì)區(qū)O1陽性細胞的IOD值差異有統(tǒng)計學意義（F=351.48～790.49，P均＜0.001）；腦室旁白質(zhì)區(qū)O1陽性細胞IOD值于術后1、4、7天逐漸上升，術后7天達最高值，術后14天陽性表達減少。在不同時間點，三組大鼠之間O1陽性細胞的IOD值差異有統(tǒng)計學意義（F=155.46～447.11，P均＜0.001）；在各個時間點，模型組與實驗組O1陽性細胞的IOD值均較假手術組低，模型組更低于實驗組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表2、圖3。

圖1 三組術后7天腦組織病理改變和14天腦室大小變化

圖2 三組大鼠術后7天腦室周圍白質(zhì)區(qū)O4表達（SP×400）

圖3 三組大鼠術后7天腦室周圍白質(zhì)區(qū)O1表達（SP×400）

表1 不同時間三組大鼠腦室旁白質(zhì)區(qū)O4陽性細胞IOD值比較 （n=8，±s）

表1 不同時間三組大鼠腦室旁白質(zhì)區(qū)O4陽性細胞IOD值比較 （n=8，±s）

注：1)與假手術組比較，P＜0.01；2)與模型組比較，P＜0.01

組 別 術后1 天 術后4 天 術后7天 術后14 天 F值 P假手術組 30 718.23±1 369.60 34 572.70±1 338.35 41 599.70±1 805.57 35 618.67±1 383.31 220.37 ＜0.001模型組 18 689.76±959.211) 25 495.60±1 132.271)29 894.43±1 107.931)24 722.16±949.431) 500.29 ＜0.001實驗組 24 939.86±1 173.741)2)29 730.60±1 129.481)2)38 855.97±1 048.041)2)33 581.87±1 708.761)2) 470.93 ＜0.001 F值 624.33 341.53 483.03 421.38 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表2 不同時間三組大鼠腦室旁白質(zhì)區(qū)O1陽性細胞IOD值比較 （n=8，x±s）

3 討論

早產(chǎn)兒腦損傷主要是腦白質(zhì)損傷和腦室周圍-腦室內(nèi)出血，腦白質(zhì)損傷包括PVL和彌漫性腦白質(zhì)損傷，是導致早產(chǎn)兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙的主要原因[5]，其發(fā)生與早產(chǎn)兒腦血管解剖的特殊性、壓力被動性腦血流、晚期少突膠質(zhì)細胞前體對缺氧缺血高度敏感及宮內(nèi)感染有關。生后1～5天新生SD大鼠少突膠質(zhì)細胞以晚期少突膠質(zhì)細胞前體細胞為主，主要分布于腦室周圍白質(zhì)、胼胝體和皮質(zhì)下白質(zhì)，2日齡SD大鼠的晚期少突膠質(zhì)細胞前體數(shù)量最多，易受缺氧缺血或感染損傷。本研究實驗動物選用2日齡SD大鼠，與人類24～32周早產(chǎn)兒發(fā)生PVL的時間窗一致[6]。經(jīng)腦組織HE染色病理檢查證實，本研究中新生2日齡鼠腦缺氧缺血后腦室周圍白質(zhì)區(qū)、皮質(zhì)下白質(zhì)神經(jīng)細胞出現(xiàn)水腫，細胞間隙增寬；隨著日齡增加，可見液化性壞死灶，有篩孔狀壞死灶及囊腔形成，左側側腦室稍擴大，到術后14天時PVL模型組左側腦室進一步擴大，腦室周圍出現(xiàn)軟化灶，與早產(chǎn)兒PVL的病理改變相符，說明選擇2日齡新生SD大鼠經(jīng)腦缺血缺氧后成功制作PVL模型。

研究表明，晚期少突膠質(zhì)細胞前體的特異性標記抗原O4(+)，未成熟的少突膠質(zhì)細胞O4(+)、O1(+)，晚期少突膠質(zhì)細胞前體受損后發(fā)育成為未成熟少突膠質(zhì)細胞的數(shù)量減少，從而使O4、O1陽性細胞的表達減少[7]。因此檢測腦室周圍白質(zhì)中O4、O1陽性細胞的表達情況可反映少突膠質(zhì)細胞的受損以及發(fā)育成熟程度。本研究三組新生大鼠術后4天開始O1陽性細胞逐漸增多、7天達高峰、14天開始下降，符合新生鼠出生少突膠質(zhì)細胞分化成熟過程和特點。各個時點O1和O4的表達均以假手術組最多、實驗組次之、模型組最少，提示2日齡新生鼠腦缺氧缺血導致晚期少突膠質(zhì)細胞前體受損，使未成熟的少突膠質(zhì)細胞減少，導致O1陽性和O4陽性細胞減少；外源性應用孕酮后可減輕新生鼠腦缺氧缺血所致腦室周圍白質(zhì)病理損害，提示外源性孕酮可促進腦室周圍白質(zhì)O1和O4的表達，使晚期少突膠質(zhì)細胞前體向未成熟少突膠質(zhì)細胞發(fā)育和分化，促進髓鞘形成，對腦白質(zhì)損傷起到保護作用[8]。

孕酮除在卵巢和胎盤可合成外，在神經(jīng)系統(tǒng)的星型膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞中也能合成，其受體主要位于海馬、大腦皮質(zhì)、小腦、下丘腦、嗅球等部位[9]，孕酮與少突膠質(zhì)細胞的分化成熟、髓鞘形成，以及神經(jīng)發(fā)育有關[10]。生理水平的孕激素在體內(nèi)和體外均有神經(jīng)保護作用，腦損傷后其血中水平迅速增加，與受損神經(jīng)修復有關，對神經(jīng)損傷有明顯的保護作用。動物實驗表明，孕酮可通過減輕腦細胞水腫、調(diào)節(jié)炎癥反應、抑制凋亡、改善神經(jīng)元存活等途徑，發(fā)揮對創(chuàng)傷性腦損傷、缺血性腦損傷、脊髓病變、周圍神經(jīng)病變、脫髓鞘病變等的神經(jīng)保護作用[11]。臨床上已開始應用孕酮治療腦損傷并取得了一定療效[12]。本研究觀察腦組織病理改變和腦白質(zhì)O1、O4表達，結果提示孕酮對新生鼠腦室周圍白質(zhì)軟化有神經(jīng)保護作用，為臨床上應用孕酮防治早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷提供了新的思路。

[1]Serenius F, K?llén K, Blennow M, et al. Neurodevelopmental outcome in extremely preterm infants at 2.5 years after active perinatal care in Sweden [J]. JAMA, 2013, 309(17):1810-1820.

[2]Taniguchi H, Andreasson K. The hypoxic-ischemic encephalopathy model of perinatal ischemia [J]. J Vis Exp, 2008, (21). pii: 955. doi: 10.3791/955.

[3]Choi EK, Park D, Kim TK, et al. Animal models of periventricular leukomalacia [J]. Lab Anim Res, 2011, 27(2): 77-84.

[4]Li X, Zhang J , Zhu X, et al. Progesterone reduces inflammation and apoptosis in neonatal rats with hypoxic ischemic brain damage through the PI3K/Akt pathway [J]. Int J Clin Exp Med, 2015, 8(5):8197-8203.

[5]陳惠金，范秀芳，高喜容，等. 6家醫(yī)院147例腦損傷早產(chǎn)兒的多中心隨訪報告 [J]. 中國當代兒科雜志, 2009, 11(3):166-172.

[6]Craig A, Ling Luo N, Beardsley DJ, et al. Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human [J]. Exp Neurol, 2003, 181(2):231-240.

[7]Yang Y, Lewis R, Miller RH. Interactions between oligodendrocyte precursors control the onset of CNS myelination [J]. Dev Biol, 2011, 350(1): 127-138.

[8]Kaur P, Jodhka PK, Underwood WA, et al. Progesterone increases brain-derived neuroptrophic factor expression and protects against glutamate toxicity in a mitogen-activated protein kinase- and phosphoinositide-3 kinase-dependent manner in cerebral cortical explants [J]. J Neurosci Res, 2007, 85(11):2441-2449.

[9]Meffre D, Labombarda F, Delespierre B, et al. Distribution of membrane progesterone receptor alpha in the male mouse and rat brain and its regulation after traumatic brain injury [J]. Neuroscience, 2013, 231:111-124.

[10]Kelleher MA, Palliser HK, Walker DW, et al. Sex-dependent effect of a low neurosteroid environment and intrauterine growth restriction on foetal guinea pig brain development [J]. J Endocrinol, 2011, 208(3):301-309.

[11]Deutsch ER, Espinoza TR, Atif F, et al. Progesterone's role in neuroprotection, a review of the evidence [J]. Brain Res, 2013, 1530:82-105.

[12]Robertson CL, Fidan E, Stanley RM, et al. Progesterone for neuroprotection in pediatric traumatic brain injury [J]. Pediatr Crit Care Med, 2015, 16(3):236-244.

Effect of progesterone on the expression of O4 and O1 in the white matter of neonatal rat model with periventricular leukomalacia

LEI Xianming, YANG Jie, CAO Yuntao
(Department of Neonatology, Af fi lated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563000, Guizhou, China)

ObjectiveTo explore the effect of progesterone on the expression of O4 and O1 in the white matter of neonatal rat model with periventricular leukomalacia (PVL).Methods2-day-old neonatal SD rats were randomly divided into model group, experimental group, and sham operation group. Rats' left common carotid artery was ligated and exposed to hypoxia (8%O2+92%N2) for 0.5 h in both the model group and experimental group to build the PVL animal model. The rats in experimental group was injected intraperitoneally with progesterone 10 mg/(kg·d) immediately after cerebral hypoxia ischemia. In sham operation group, rats' left common carotid artery was only isolated without ligation and hypoxia. 1, 4, 7, and 14 days after operation, the pathological changes of brain tissue were compared among three groups. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of O1 and O4 in the cerebral cortex of rats in three groups at different time points.ResultsThere were no abnormal pathological changes in the white matter in the sham operation group at each time point. The left ventricular enlargement and periventricular leukomalacia were found in both model and experimental groups, while the pathological damages of white matter in experimental group were signi fi cantly lighter than those in model group at each time point. The integral optical density (IOD) of O1 and O4 positive cells in the cerebral cortex of the three groups was gradually increased at day 1, day 4, and day 7 after operation and reached the peak level at day 7 , then was decreased at day 14 after operation. There was statistically signi fi cant difference (P＜0.01). At day 1, day 4, day 7, and day 14, the integral optical density (IOD) of O1 and O4 positive cells in the cerebral cortex of sham operation group was highest, followed by experimental group and model group, and there was signi fi cant difference (P＜0.01).ConclusionProgesterone can reduce the pathological damage in the cerebral cortex in neonatal rats with PVL, and promote the expression of O1 and O4 in the periventricular white matter, which can promote the differentiation and maturation of oligodendrocytes.

progesterone; periventricular leukomalacia; oligodendrocyte marker O4; oligodendrocyte marker O1; neonatal rat

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.04.018

2016-09-23)

(本文編輯：蔡虹蔚)

貴州省衛(wèi)計委資助課題（No.gzwjkj2014-1-072)；遵義醫(yī)學院碩士點基金資助課題(No.2C2201603186)

曹云濤 電子信箱：cyto827@aliyun.com

假手術組各時點腦白質(zhì)區(qū)未見異常病理改變；模型組和實驗組均出現(xiàn)左側腦室擴大和腦室周圍白質(zhì)軟化灶等病理改變，但實驗組各時點腦白質(zhì)病理改變均明顯輕于模型組。三組大鼠腦室旁白質(zhì)區(qū)O1、O4陽性細胞的積分光密度（IOD）在術后1、4、7天的表達逐漸增加，第7天達高峰，第14天下降，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）。在術后1、4、7、14天，三組腦室旁白質(zhì)區(qū)O1、O4陽性細胞IOD在同一時間點均以假手術組最多，實驗組其次，模型組最少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結論孕酮可減輕新生大鼠PVL模型動物腦室旁白質(zhì)區(qū)病理損傷，促進腦室周圍白質(zhì)O1、O4表達，促進少突膠質(zhì)細胞分化成熟。