愈潰膜對6種常見細(xì)菌的體外抑菌試驗(yàn)研究

王麗萍，段曉穎，孫廣科

(河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍是口腔科常見病、多發(fā)病，患病率高達(dá)25%。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，其發(fā)病與免疫功能低下、細(xì)菌與病毒感染、內(nèi)分泌失調(diào)、自主神經(jīng)功能和消化道功能紊亂有關(guān)。中醫(yī)認(rèn)為，該病與脾胃實(shí)熱、心火上炎、陰虛內(nèi)熱、濕熱內(nèi)蘊(yùn)、陰虛濕熱夾雜導(dǎo)致灼傷營血、腐蝕肌膜有關(guān)，或與脾腎陽虛、脾胃氣虛、寒熱錯雜所致溫化濕調(diào)、津液停滯、寒濕困于口腔，肌膜潰爛有關(guān)。西藥中用于治療口腔潰瘍的膜劑多以激素或抗生素類為主要成分，而口腔潰瘍易反復(fù)發(fā)作，長期使用，副作用較大，臨床依從性差?；诖嗽?，我院研制了治療口腔潰瘍的中藥膜劑愈潰膜。愈潰膜為生物黏附單向釋藥膜劑，由胡黃連、牡丹皮等組方，具有清熱涼血、活血散瘀的功能。該貼膜由具生物黏附性的載藥層和不具生物黏附性的背襯層復(fù)合而成，口腔黏附時間長，同時能阻斷外界對潰瘍面的刺激，載藥層單向釋藥，減輕了藥物苦味，維持了藥物局部的有效治療濃度，臨床治療效果較好。

1 材料與方法

1．1 儀器、試藥與菌株

CP225D Sartorius十萬分之一天平(德國賽多利斯＜北京＞有限公司);SXK－103型凈化工作臺(安徽省蚌埠凈化設(shè)備廠);SW－CJ－IB型單人單面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司);電子天平(上海醫(yī)用激光儀器廠常熟分廠，型號為DT－300A);LMQ－R立式滅菌器(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司);PYXDHS－50X65－BS－Ⅱ隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);MJ－160B－Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)。

愈潰膜(由本院提供，批號為101123，每片含原生藥0．036 g);蜂膠口腔膜(北京紫竹藥業(yè)有限公司，批號為20100913)。

乙型溶血性鏈球菌(32210－4a)、甲型溶血性鏈球菌(32213－8)為凍干菌粉，均由中國藥品生物制品檢定所提供;金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44 102]、銅綠假單胞菌 [CMCC(S)10104]、白色念珠菌[CMCC(F)98 001]，均為斜面保存第2代菌種，由河南省食品藥品檢驗(yàn)所提供。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號為110126)、MH瓊脂培養(yǎng)基(批號為100611)、MH 肉湯培養(yǎng)基(批號為 100428)、pH=7．0氯化鈉 － 蛋白胨水緩沖液(批號為1007082)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號為100428)、改良沙氏瓊脂培養(yǎng)基(批號為110301)均由北京三藥科技開發(fā)有限公司提供。沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基系按2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅩⅢ微生物檢定項(xiàng)下規(guī)定配制。

氯化鈉注射液(河南太龍藥業(yè)股份有限公司，批號為10091321);無菌脫纖維綿羊血(鄭州益康生物工程有限公司，批號為20110408);標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(上海尚寶生物科技有限公司，批號為100402);血瓊脂平板(河南聯(lián)博生物科技有限公司)。

1．2 方法[1-2]

菌種活化:用滅菌吸管將液體培養(yǎng)基約0．3 mL分別注入被啟開的甲型溶血性鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌菌種安瓿中并吹打，使凍干菌種溶解成菌懸液;將上述菌懸液全部吸出，分別接種到含5%無菌脫纖羊血的10 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，(35±1)℃，5%CO2培養(yǎng)20 h，制成第1代菌種;再將第1代菌種傳代培養(yǎng)，復(fù)壯活化至第2代，備用。接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的斜面培養(yǎng)物置營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中;以上各菌均置細(xì)菌培養(yǎng)箱中，在(35±1)℃溫度環(huán)境下培養(yǎng)20 h;接種白色念珠菌于沙氏肉湯培養(yǎng)基中，置霉菌培養(yǎng)箱中，在(25±1)℃溫度環(huán)境下培養(yǎng)24 h。

溶液制備:取上述各菌的新鮮培養(yǎng)物1 mL加無菌生理鹽水，按1∶10倍比稀釋至1∶1 000，制成菌懸液，備用。準(zhǔn)確稱取愈潰膜、蜂膠口腔膜，用滅菌純凈水稀釋成質(zhì)量濃度為1 000 g/L的供試液，備用。

最低抑菌濃度(MIC)測定:取13 mm×100 mm滅菌具硅膠塞試管132支，排成12排，每排11支;在每管中加相應(yīng)無菌培養(yǎng)基2．0 mL(其中甲型溶血性鏈球菌和乙型溶血性鏈球菌培養(yǎng)液需加入5%胎牛血清)，于第1管中加供試液 2．0 mL，按二倍稀釋法[1－2]倍比稀釋成系列濃度，編號為1－11的試管中藥液最終質(zhì)量濃度依次為500，250，125，62．5，31．3，15．6，7．8，3．9，1．95，0．98，0 g/L(第11管不加藥，為陽性對照管)。向各管中加供試菌懸液0．1 mL(其中第10管不加菌液，為藥液對照管)，培養(yǎng)24 h后(白色念珠菌可適當(dāng)延長培養(yǎng)時間)，觀察記錄，重復(fù)試驗(yàn)2次。

結(jié)果判斷:本試驗(yàn)中，以第10管(藥液對照管)對應(yīng)的平板無菌生長;第11管(陽性對照管)對應(yīng)平板有菌生長，結(jié)果方為有效。觀察結(jié)果，找出阻止細(xì)菌生長的最低藥物質(zhì)量濃度(MIC)。將無菌生長的最低藥物質(zhì)量濃度及其鄰近兩管劃線接種于相應(yīng)的瓊脂平板上，適當(dāng)培養(yǎng);取出，觀察有無細(xì)菌生長，有細(xì)菌生長的記為“+”，無細(xì)菌生長的記為“－”;低于5 cfu/mL者按“－”計(jì)。結(jié)果以細(xì)菌不生長的最低質(zhì)量濃度為藥物的最低抑菌濃度(MIC)。

2 結(jié)果

結(jié)果見表1。愈潰膜對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、甲型溶血性鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌的最低抑菌濃度分別為 31．3，7．8，62．5，62．5，3．9，3．9 g/L。蜂膠口腔膜對大腸埃希菌在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)無抑制作用，未找到最低抑菌濃度;對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為3．9 g/L;對銅綠假單胞菌在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)無抑制作用，未找到最低抑菌濃度;對白色念珠菌的最低抑菌濃度為62．5 g/L;對甲型溶血性鏈球菌的最低抑菌濃度為7．8 g/L，對乙型溶血性鏈球菌的最低抑菌濃度為3．9 g/L。體外抑菌試驗(yàn)表明，愈潰膜對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)抑菌效果明顯優(yōu)于蜂膠口腔膜，后者對上述2種菌均不敏感，幾乎無抑制作用;對于其余4種菌，兩者最低抑菌濃度接近，無明顯差異，其中愈潰膜對甲型溶血性鏈球菌的抑菌效果稍優(yōu)于蜂膠口腔膜，對于乙型溶血性鏈球菌、白色念珠菌二者抑菌效果相當(dāng)，對金黃色葡萄球菌的抑菌效果蜂膠口腔膜略優(yōu)。

表1 藥物對6種細(xì)菌的抑制作用

本次試驗(yàn)中，以試驗(yàn)藥物的質(zhì)量濃度的最低抑菌濃度作為對比指標(biāo)，以片換算最低抑菌濃度，比較單片愈潰膜與蜂膠口腔膜的體外抑菌力。結(jié)果見表2。試驗(yàn)中，樣品藥物愈潰膜的單片質(zhì)量為0．028 g，而蜂膠口腔膜的單片質(zhì)量約為0．016 1 g，故同樣質(zhì)量濃度的試驗(yàn)液中，蜂膠口腔膜的片數(shù)多于愈潰膜，即對于抑制同樣濃度的試驗(yàn)菌液，單獨(dú)1片的愈潰膜的體外抑菌作用優(yōu)于蜂膠口腔膜。該制劑臨床應(yīng)用1年來，療效觀察結(jié)果顯示其治療有效率非常高，見表3。若病程3 d以內(nèi)者用藥，治愈率可達(dá)100%。

表2 以片數(shù)換算的最低抑菌濃度(片/mL)

表3 愈潰膜對復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的療效[例(%)]

3 討論

雖然口腔潰瘍本身并不是由細(xì)菌感染引起的疾病，但往往合并細(xì)菌感染。因此，抗菌消炎在口腔潰瘍的治療中尤為重要。愈潰膜組方嚴(yán)謹(jǐn)，配伍精妙，方中多種成分如胡黃連[3－4]、牡丹皮[5－6]、冰片[7]等都有一定的抑菌抗炎作用。其中冰片易透過細(xì)胞壁，引起細(xì)胞膜損傷，破壞及改變其通透性[8]，冰片中的主要成分龍腦與異龍腦均能抑制炎癥介質(zhì)釋放及拮抗前列腺素。另外，愈潰膜體外釋放試驗(yàn)結(jié)果顯示，其釋放符合Higuch方程，屬于緩釋膜劑，使藥物作用時間延長，其具有的清熱解毒、生肌斂瘡的作用通過藥效成分在病損部位直接與細(xì)菌接觸，緩慢釋放，維持病損部位保持有效的藥物治療濃度，從而發(fā)揮抑菌作用，控制局部感染，加速炎癥消退及黏膜修復(fù)，縮短潰瘍面愈合時間。相比西藥，愈潰膜具有整體調(diào)節(jié)、多靶點(diǎn)治療的特點(diǎn)，在治療口腔潰瘍方面有其獨(dú)到之處。

試驗(yàn)表明，愈潰膜對上述6種菌有較好的抑制作用，對治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍達(dá)到了標(biāo)本兼治的目的，有著較高的臨床實(shí)用價值和廣泛的市場前景。

愈潰膜對口腔潰瘍的治療機(jī)理還需進(jìn)一步研究，今后應(yīng)從臨床研究、藥物代謝動力學(xué)及分子生物學(xué)的角度進(jìn)一步探討其作用機(jī)理。

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