單寧酶制備研究進(jìn)展

王 揮 黃壽恩，2 顏 紅 黎繼烈 李忠海

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004；2.長沙理工大學(xué)，湖南 長沙 410015；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

單寧酶制備研究進(jìn)展

王 揮1黃壽恩1，2顏 紅3黎繼烈1李忠海1

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004；2.長沙理工大學(xué)，湖南 長沙 410015；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

單寧酶主要由曲霉屬等微生物發(fā)酵制備。它能夠水解單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵，生成重要的工業(yè)原料沒食子酸等化合物。單寧酶已廣泛應(yīng)用于食品飲料、化妝品工業(yè)和飼料工業(yè)等領(lǐng)域。文章著重綜述國內(nèi)外在單寧酶菌種選育、培養(yǎng)基發(fā)酵體系、發(fā)酵生產(chǎn)、提取與分離純化、固定化技術(shù)等制備方法方面研究的新進(jìn)展，分析單寧酶制備研究的發(fā)展趨勢。

單寧酶；菌種選育；發(fā)酵培養(yǎng)基；固定化酶

單寧酶又稱鞣酸酶，全稱為單寧酯酰水解酶（tannase，EC 3.1.1.20），是由微生物在單寧酸存在的條件下誘導(dǎo)合成的一種細(xì)胞膜結(jié)合酶。單寧酶可作為脫除單寧成分的添加劑廣泛應(yīng)用于茶、葡萄酒、啤酒及果汁飲料的生產(chǎn)中，如用于茶飲料沉淀抑制劑、啤酒澄清劑、蛋白純化單寧酸去除劑等；單寧酶還可用于制備沒食子酸丙脂抗氧化劑、兒茶素單體和皮革鞣制劑等工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域。目前，酶制劑工業(yè)發(fā)達(dá)的國家，如美國、日本等已開發(fā)出單寧酶在皮革、化妝品、食品飲料、精細(xì)化工、飼料工業(yè)等方面的多種用途［1］。隨著單寧酶應(yīng)用日趨廣泛，市場需求量不斷加大，國內(nèi)外學(xué)者對單寧酶的制備進(jìn)行了深入的研究。

1 產(chǎn)單寧酶菌種的選育

產(chǎn)單寧酶的菌種廣泛存在于自然界植物與微生物中，但從自然環(huán)境中篩選出菌種的單寧酶酶活力往往不高，利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，尤其是生物技術(shù)選育高產(chǎn)、高活力的單寧酶菌株是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。

郭魯宏等［2］利用富集培養(yǎng)技術(shù)，從天然源分離得到一株具有較高單寧酶活性的黑曲霉菌株。后來，該作者［3］用紫外線誘變處理黑曲霉No.13菌株，獲得一株制備原生質(zhì)體的起始菌，對該誘變株進(jìn)行方案優(yōu)化和篩選，最后得到一株具有穩(wěn)定遺傳性的單寧酶菌株。龔加順［4］以黑曲霉9401為出發(fā)菌株，經(jīng)3次N＋離子注入誘變，選育出一株單寧酶高產(chǎn)菌株9701，應(yīng)用于紅茶"冷后渾"的轉(zhuǎn)溶。結(jié)果表明，經(jīng)誘變選育的菌株比出發(fā)菌的酶活提高了2.89倍。周紀(jì)東［5］以產(chǎn)單寧酶黑曲霉菌株為出發(fā)菌，采用微波誘變與化學(xué)誘變相結(jié)合的復(fù)合選育獲得高產(chǎn)單寧酶的黑曲霉L21菌株，在最優(yōu)發(fā)酵條件下，該菌株單寧酶酶活力可達(dá)225.8U／mL。宋志萍等［6］從香蕉莖葉、茶葉及香蕉土壤、茶土壤環(huán)境中經(jīng)初篩和復(fù)篩分離純化出16株產(chǎn)單寧酶的菌株，并篩選出3株高酶活值的菌株。Rintu B等［7］采用混合培養(yǎng)技術(shù)從富含單寧酸的基質(zhì)生產(chǎn)單寧酶和沒食子酸，即將絲狀真菌米根酶和惡臭曲霉兩種酶進(jìn)行混合培養(yǎng)，產(chǎn)生的單寧酶酶活力和轉(zhuǎn)化率明顯優(yōu)于單獨(dú)培養(yǎng)的酶活力。Jogeswar S P［8］用紫外線照射、加熱和3－硝基5－甲胍處理米根霉和惡臭曲霉混合培養(yǎng)生產(chǎn)的孢子粉使之誘變，從菌落中分離篩選得到的最優(yōu)突變株，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后所產(chǎn)單寧酶和沒食子酸的生物轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到53.6U／mL和95.2%。Murugan K 等［9］從制革廠、栲膠廠等排放的污水中篩選和分離單寧酶真菌，獲得可產(chǎn)單寧酶的菌株。欒麗杰等［10］以澀柿為培養(yǎng)基質(zhì)，通過初篩和復(fù)篩，篩選出的最佳菌株經(jīng)鑒定為產(chǎn)生澀柿單寧酶的黑曲霉純種菌株，菌株培養(yǎng)和測試表明，該菌株COD去除率高，單寧耐受力強(qiáng)，具有開發(fā)成為工程菌株的潛力。谷文等［11］從鐵冬青等4種植物的新鮮莖、葉組織中分離得到52株真菌，經(jīng)平板透明圈法初篩得到16株產(chǎn)單寧酶菌株。在最佳發(fā)酵條件下，選育的1株木霉屬真菌 No.MY－P－07酶活力達(dá)到0.392μmol／（min·mL）。

上述研究表明單寧酶菌種選育的關(guān)鍵是從自然環(huán)境中篩選出高產(chǎn)菌株。而兩種或兩種以上菌種混合培養(yǎng)往往比單獨(dú)培養(yǎng)所產(chǎn)單寧酶的活力高，菌種的混合培養(yǎng)是可提高單寧酶的產(chǎn)量。

2 產(chǎn)單寧酶培養(yǎng)基

2.1 培養(yǎng)基底物及其工藝優(yōu)化

在產(chǎn)單寧酶的培養(yǎng)基發(fā)酵體系中，單寧酸或含有沒食子酸的基質(zhì)為必需組分。在發(fā)酵法制備單寧酶的研究中，往往采用直接添加純單寧酸或選擇富含單寧酸的物質(zhì)作為培養(yǎng)基底物。某些富含單寧酸的天然植物用于發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的基質(zhì)底物，甚至優(yōu)于用純單寧酸作底物。如Pradeep K等［12］分別選用8種含單寧酸的植物樹皮提取液作底物，液體深層發(fā)酵制備單寧酶，其酶活比用純單寧酸發(fā)酵所產(chǎn)單寧酶高兩倍。Mukherjee G等［13］分別用包含45%，58%單寧酸的訶子（terminalia chebula）和肉莢云實(shí)（caesalpinia digyna）的果實(shí)粉末，進(jìn)行由黑曲霉固體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的研究獲得成功，利用廢棄物生產(chǎn)單寧酶可以變廢為寶，經(jīng)濟(jì)環(huán)保。Sabu A等［14］研究比較了羅望子籽粉、棕櫚仁餅、麥麩和咖啡殼固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)單寧酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)咖啡殼所產(chǎn)胞外單寧酶最多。據(jù)B Trevino－Cueto等［15］報(bào)導(dǎo)，生長在美國西南、墨西哥北部沙漠中的一種名為Larrea tridentate Cov.富含單寧酸的植物，可作為真菌固態(tài)發(fā)酵積累沒食子酸和單寧酶的便宜底物。

近年來，諸多學(xué)者以提高底物轉(zhuǎn)化率和酶活力為目標(biāo)，對產(chǎn)單寧酶發(fā)酵培養(yǎng)的優(yōu)化進(jìn)行了探討。林健輝等［16］以曲霉T3－5－1為培養(yǎng)菌株，測得該曲霉在優(yōu)化培養(yǎng)基配比及培養(yǎng)條件下產(chǎn)單寧酶的活力比優(yōu)化前提高近4倍。馬如意等［17］采用響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對一株黑曲霉固體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，選定玉米漿、五倍子和MgSO4為培養(yǎng)基影響因子，建立的模型優(yōu)化預(yù)測值經(jīng)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)證明，菌株產(chǎn)單寧酶酶活力與優(yōu)化前相比提高了1.82倍。由此可見，培養(yǎng)基配比及其優(yōu)化是提高產(chǎn)單寧酶活力和底物轉(zhuǎn)化率的重要途徑。

2.2 培養(yǎng)基體系中的碳、氮源

碳源和氮源是微生物生長的必需物質(zhì)，微生物種類不同或微生物積累的代謝產(chǎn)物不同，對碳源和氮源的需求都有差異。劉如石等［18］研究用不同碳、氮源的種類和比例等因素對黑曲霉產(chǎn)單寧酶的影響，結(jié)果表明，豆粕＋NH4NO3與K2HPO4等碳、氮源的交互作用極顯著，而豆粕＋NH4NO3、單寧、小麥粉對產(chǎn)單寧酶作用明顯。周紀(jì)東［5］通過試驗(yàn)比較了蔗糖，葡萄糖，糊精，可溶性淀粉，小麥粉，羧甲基纖維素等碳源、NaNO3、NH4Cl、尿素、玉米粉、酵母浸膏等氮源，對黑曲霉LZI菌株產(chǎn)單寧酸的影響。Bratali K等［19］研究認(rèn)為大豆提取液在0.05%～1.0% （m／V）時(shí)，對單寧酶的活力有抑制作用，而當(dāng)培養(yǎng)液中硫酸銨鐵、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨濃度為0.1% （m／V），尿素濃度為1.5mol時(shí)，單寧酶活力得到提高。游見明［20］用黑曲霉QG0301發(fā)酵制備單寧酶，正交試驗(yàn)優(yōu)化碳、氮源配比和其它條件，單寧酶產(chǎn)量均值達(dá)到18.55U／mL。曾維麗等［21］分別考察了葡萄糖，乳糖，淀粉、蔗糖等碳源和 NaNO3、尿素、NH4Cl、（NH4）2SO4等氮源，對黑曲霉產(chǎn)塔拉單寧水解酶的影響，在相應(yīng)適宜條件下，產(chǎn)塔拉單寧水解酶的酶活力達(dá)44.29U／mL。Banerjee D等［22］、Enemuor S C等［23］先后報(bào)道了用出芽短梗霉、溜曲霉發(fā)酵產(chǎn)單寧酶，對碳、氮源及其它培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高單寧酶產(chǎn)量。這些研究說明，在培養(yǎng)基體系中，單寧與非單寧碳、氮源的種類和比例對產(chǎn)單寧酶活力均有重要影響。

3 發(fā)酵法制備單寧酶

3.1 液體發(fā)酵法

液體發(fā)酵法是指以液體培養(yǎng)基作原料進(jìn)行微生物的培養(yǎng)和產(chǎn)酶的方法。

Iibuchi S等［24］是較早報(bào)道發(fā)酵法制備單寧酶的研究者之一。他們用單寧酸作誘導(dǎo)米曲霉菌株，并優(yōu)化了產(chǎn)單寧酶的最適培養(yǎng)條件。Brsadoo S等［25］對日本黑曲霉產(chǎn)單寧酶進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，所產(chǎn)單寧酶酶活由29.13U／mL 提高到33.06U／mL。湯茜［26］從多株霉菌中篩選出單寧酸降解能力較強(qiáng)的無花果曲霉，并進(jìn)行了真菌單寧酸液態(tài)發(fā)酵降解率的測定和無花果曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的最適發(fā)酵條件的探討。欒麗杰［27］從澀柿作為微生物生長的微環(huán)境中獲得黑曲霉純種菌株，液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)單寧酶，將經(jīng)優(yōu)化的培養(yǎng)基置于160r／min搖床中恒溫培養(yǎng)（28℃）72h，獲得了較大生物量和最高產(chǎn)酶能力。謝曉莉等［28］對黑曲霉B0201液體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的研究表明，該菌株液體發(fā)酵所產(chǎn)胞內(nèi)酶的酶活可達(dá)到145.2U／mL。液體發(fā)酵產(chǎn)生的單寧酶不易污染雜菌，條件易于控制，可隨時(shí)檢測酶活力，但液體發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶往往酶活較低，且該法所產(chǎn)單寧酶主要為胞內(nèi)酶，細(xì)胞破壁工藝繁瑣，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。

3.2 固體發(fā)酵法

固體發(fā)酵法是指在固體、半固體或富含營養(yǎng)物質(zhì)的惰性載體上進(jìn)行微生物培養(yǎng)和產(chǎn)酶的方法。該方法與液體發(fā)酵法相比在胞外產(chǎn)酶、pH和熱穩(wěn)定性等方面具有優(yōu)越性，酶活和底物的生物轉(zhuǎn)化率較高，且設(shè)備簡單，易于推廣應(yīng)用。

謝曉莉等［29］研究黑曲霉產(chǎn)單寧酶采用半固體發(fā)酵法，最優(yōu)條件下單寧酶的活力最高可達(dá)144.39U／mL，但所產(chǎn)酶主要為胞內(nèi)酶。Chatterjee R等［30］以麩皮和單寧組成培養(yǎng)基，在40℃、72%濕度、pH 5.0條件下培養(yǎng)4d，用稻根菌固體發(fā)酵制備得到單寧酶。Lekha P K 等［31］對黑曲霉DKL104產(chǎn)單寧酶進(jìn)行了不同發(fā)酵方法的研究，結(jié)果顯示，液體發(fā)酵黑曲霉所產(chǎn)單寧酶主要是胞內(nèi)酶，而固體發(fā)酵所產(chǎn)的單寧酶絕大部分為胞外酶；消耗等量的培養(yǎng)基，固體發(fā)酵的培養(yǎng)時(shí)間僅為液體表層發(fā)酵、液體深層發(fā)酵的1／2，而單寧酶酶產(chǎn)量分別為二者的1.8倍和2.5倍。Cristóbal N A等［32］研究發(fā)現(xiàn)，與液體深層發(fā)酵相比較，用固體發(fā)酵黑曲霉Aa－20的單寧酶產(chǎn)量提高兩倍以上，且固體發(fā)酵對高單寧酸濃度的耐受力增強(qiáng)，所產(chǎn)單寧酶的雜蛋白酶較少，酶活力更高。邱樹毅等［33］發(fā)明了一種用五倍子生料經(jīng)固體發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶的方法，采用生料直接接種黑曲霉固體發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶。避免了高溫對原料的破壞，設(shè)備和生產(chǎn)流程簡單，生產(chǎn)效率高。

工業(yè)上固體發(fā)酵采用的分批發(fā)酵模式，存在著發(fā)酵接種量大、不能重復(fù)利用、生產(chǎn)效率低（易污染雜菌）的缺點(diǎn)，Van de Lagemaat J等［34］研究用含單寧酸的模擬底物制備光孢青霉單寧酶，嘗試以不用補(bǔ)料接種，連續(xù)供給固體基質(zhì)的方法進(jìn)行固體發(fā)酵。這種進(jìn)行連續(xù)固體發(fā)酵克服了上述分批固體發(fā)酵的不足。但連續(xù)固體發(fā)酵的生長動力學(xué)的關(guān)系、接種機(jī)制及工藝條件控制等尚需進(jìn)一步研究。

4 單寧酶的提取與分離純化

單寧酶是一種細(xì)胞膜結(jié)合酶，既存在于細(xì)胞內(nèi)，又存在于細(xì)胞外，對于菌絲體中的單寧酶要先進(jìn)行細(xì)胞破壁。在單寧酶的分離純化過程中，破壁取酶是主要的難題。如曲霉屬的單寧酶為胞內(nèi)酶，分布在真菌的細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間，結(jié)合得非常牢固，相當(dāng)于固定在細(xì)胞中。只有將細(xì)胞破壁，使酶盡可能地釋放出來，才能高效提取單寧酶。近年來，國內(nèi)外學(xué)者以提高產(chǎn)單寧酶活力為目標(biāo)，探索了多種細(xì)胞破壁方法。Barthomeuf C.等［35］利用凍融法破壁，提高了所得單寧酶活力，在后續(xù)研究中，把產(chǎn)單寧酶的菌種與產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的鏈霉菌菌絲體進(jìn)行保溫共培養(yǎng)，即酶法破壁的方法提取單寧酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單寧酶胞內(nèi)酶的釋放量達(dá)到53%。Gupta R.等［36］報(bào)導(dǎo)了在產(chǎn)單寧酶發(fā)酵液的等電點(diǎn)，加入單寧和PEG－6000沉淀單寧酶蛋白，可快速提取胞外單寧酶。

單寧酶的純化通常采用層析法，如離子交換柱、疏水層析、分子篩層析等方法。Beverini M 等［37］研究了從米曲霉（Asp oryzae）No.7發(fā)酵液中分離純化單寧酶：加入硫酸銨達(dá)到0.8飽和度，放置15h后，用加有助濾劑硅藻土535的漏斗過濾，再將沉淀溶于水中，離心后得到粗單寧酶液，進(jìn)一步用DEAE－Sephadex A50離子交換和Sephadex G－100凝膠過濾，獲得了純化的單寧酶；Hossam S等［38］先將發(fā)酵液過濾和離心，用硫酸銨（65%）沉淀單寧酶，再離心溶解后分別通過Sephadex G－25層析柱、DEAE－纖維素陰離子交換層析柱和Sephadex G－150層析柱，得到電泳純級的單寧酶；倪田表等［39］采用兩步法快速分離純化黑曲霉產(chǎn)單寧酶，其純度經(jīng)檢驗(yàn)亦達(dá)到電泳純。王維維等［40］將黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)胞外單寧酶，經(jīng)硫酸銨分級沉淀、DEAE－纖維素層析、葡聚糖G－150凝膠柱層析純化，獲得的單寧酶純化倍數(shù)高達(dá)18.44。

20世紀(jì)80年代興起了一種蛋白質(zhì)提純新技術(shù)：反向膠束系統(tǒng)［41，42］，其基本原理［43］是在有機(jī)溶劑中，當(dāng)表面活性劑的疏水性基團(tuán)向外與有機(jī)溶劑接觸，親水性基團(tuán)向內(nèi)排列形成極性區(qū)域時(shí)，形成一個(gè)個(gè)膠團(tuán)，膠團(tuán)內(nèi)部能為酶提供最佳微環(huán)境。酶分子可容納于膠團(tuán)之中而與其他雜質(zhì)相分離。與其它提純方法相比，反向膠束系統(tǒng)可以有效地提高單寧酶的回收量，純化時(shí)間大為縮短，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

5 單寧酶的固定化

酶作為生物催化劑，其優(yōu)點(diǎn)是：具有較高的（甚至是專一的）選擇性、良好的催化效率、溫和的反應(yīng)條件等。缺點(diǎn)是：在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫、高離子濃度和部分有機(jī)溶劑等條件下，游離狀態(tài)的酶不穩(wěn)定，酶蛋白易變性，酶的催化活性降低甚至喪失，同時(shí)，游離酶不易從底物和產(chǎn)物中分離出來，反應(yīng)產(chǎn)物純化工藝較為復(fù)雜，可溶性酶往往只能一次性地起催化作用，難以重復(fù)使用，從而限制了酶促反應(yīng)的應(yīng)用。

固定化酶技術(shù)可以克服游離酶的不足，提高酶的操作穩(wěn)定性，酶可以回收及重復(fù)使用，可實(shí)現(xiàn)連續(xù)自動化生產(chǎn)。吸附法、包埋法、交聯(lián)法和共價(jià)偶聯(lián)法等是酶固定化的主要方法［44］。Weetall H.H.等［45］采用一種具有一定孔徑的多孔玻璃珠固定單寧酶，與未經(jīng)固定化的游離酶比較，固定化單寧酶的pH穩(wěn)定范圍向堿性漂移，熱穩(wěn)定性范圍更寬。程琦等［46］采用自制的殼聚糖固定單寧酶，測得以沒食子酸丙酯作底物時(shí)固定化單寧酶的最適pH值為6.4，比游離單寧酶最適pH值（5.8）向堿性區(qū)域偏移了個(gè)pH 0.6位，而固定化單寧酶的穩(wěn)定pH值范圍比游離單寧酶有所變窄。Boadi D K等［47］比較了多種載體對單寧酶固定化的影響，結(jié)果表明，以殼聚糖包裹海藻酸鈣，用戊二醛交聯(lián)所生產(chǎn)的膠珠性能最佳。劉冠卉等［48］以殼聚糖為原料，篩選出殼聚糖海綿載體固定化單寧酶，與游離酶相比，固定化酶的最適反應(yīng)pH向酸性偏移，最適反應(yīng)溫度有所提高，對金屬離子和EDTA的穩(wěn)定性增強(qiáng)，半衰期也明顯延長。范超等［49］在玉米芯固定化單寧酶的研究中，采用Box－Behnkens試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析方法，優(yōu)化了改性玉米芯固定化單寧酶的工藝條件：單寧酶酶液與玉米芯載體比26∶1（V∶m）、pH 6.8、時(shí)間8.0h、溫度36℃。固定化單寧酶酶活力達(dá)到（16 085±5）U／g。王揮等［50］以 LX－1000HA 樹脂為載體固定化單寧酶，在最佳工藝條件下制備的固定化單寧酶，其酶活力，對溫度和pH的適應(yīng)性和穩(wěn)定性，均優(yōu)于游離酶。LX－1000HA樹脂是一種價(jià)格較低廉的國產(chǎn)樹脂，用于單寧酶固定化研究和制備具有良好的市場前景。

6 結(jié)束語

有關(guān)單寧酶的基礎(chǔ)理論與實(shí)際應(yīng)用的研究，美國、日本等開展較早，并已取得重要成果，一些公司已能進(jìn)行單寧酶的批量生產(chǎn)，而中國國內(nèi)單寧酶的生產(chǎn)尚未形成規(guī)?；a(chǎn)經(jīng)營，單寧酶的生產(chǎn)效率偏低，價(jià)格昂貴。中國生產(chǎn)單寧酶的自然資源十分豐富（中國產(chǎn)單寧酶的五倍子產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的95%），又是工業(yè)上應(yīng)用單寧酶的消費(fèi)大國（中國是茶葉生產(chǎn)、消費(fèi)和出口大國之一，茶葉產(chǎn)量占世界的1／3，進(jìn)行深加工需要大量的單寧酶）。隨著對單寧酶需求量的日益增長和研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)和選育新的高產(chǎn)單寧酶菌株、有利于提高單寧酶活力的誘導(dǎo)底物與優(yōu)化培養(yǎng)基組成；改進(jìn)和創(chuàng)新適合于工業(yè)化生產(chǎn)的單寧酶的發(fā)酵工藝，特別是固體發(fā)酵工藝、分離純化技術(shù)及生產(chǎn)設(shè)備，提高產(chǎn)酶效率，降低生產(chǎn)成本；進(jìn)一步開展固定化酶技術(shù)（包括固定化細(xì)胞技術(shù)）研究，開發(fā)實(shí)用、廉價(jià)和高效的固定化酶載體，提高單寧酶重復(fù)使用率和實(shí)現(xiàn)連續(xù)自動化生產(chǎn)，將是單寧酶制備研究的發(fā)展趨勢。

1 P K Das Mohapatra，C Maity，R S Rao，et al.Tannase production by bacillus licheni form is KBR6：optimization of submerged culture conditions by Taguchi DOE methodology［J］.Food Research International，2009，42（4）：430～435.

2 郭魯宏，楊順楷.黑曲霉單寧酶高活性菌株的誘變選育［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2000，27（2）：105～108.

3 郭魯宏，楊順楷.單寧酶產(chǎn)生菌的篩選和發(fā)酵條件研究［J］.應(yīng)用于環(huán)境生物學(xué)報(bào)，1998，4（4）：386～389.

4 龔加順.單寧酶的固定化及其在紅茶飲料澄清化中的應(yīng)用研究［D］.重慶：西南農(nóng)業(yè)大學(xué)，1998.

5 周紀(jì)東.黑曲霉產(chǎn)單寧酶的研究和有機(jī)相中固定化黑曲霉細(xì)胞生物合成沒食子酸丙酯的初探［D］.杭州：浙江大學(xué)，2002.

6 宋志萍，蔡俊鵬，曹麗芳.香蕉及茶葉中單寧降解菌株的篩選［J］.現(xiàn)代食品科技，2005，21（3）：39～41.

7 Rintu B，Gargi M.Microbial transformation of tannin－rich substrate to gallic acid through co－culture method［J］.Bioresource Technology，2005，96（8）：949～953.

8 Jogeswar S P.Strain improvement for tannase production from co－culture of Aspergillus foetidus and Rhizopus oryzae［J］.Bioresource Technology，2006，97（6）：795～801.

9 Murugan K，Saravanababu S，Arunachalam M.Screening of tannin acyl hydrolase（E.C.3.1.1.20）producing tannery effluent fungal isolates using simple agar plate and SmF proces［J］.Bioresource Technol，2007，98（4）：946～949.

10 欒麗杰，楊永濤.產(chǎn)澀柿單寧酶菌株的篩選及鑒定［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（20）：10 499～10 501.

11 谷文，楊亦陳，王石發(fā).產(chǎn)單寧酶真菌的篩選及產(chǎn)酶條件［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，34（3）：6～10.

12 Pradeep K，Das M.Production of tannase through submerged fermentation of tannin－containing plant extracts by bacillus licheniformis KBR6［J］.Polish Journal of Microbiology，2006，55（4）：1 733～1 331.

13 Mukherjee G，Banerjee R.Biosynthesis of tannase and gallic acid from tannin rich substrates by Rhizopus oryzae and Aspergillus foetidus［J］.Journal of Basic Microbiology，2004，44（1）：231～233.

14 Sabu A，Angur C，Swati C，et al.Tannase production by Lactobacillus sp. ASR－S1under Solid－state fermentation［J］.Process Biochemistry，2006，41（3）：575～580.

15 B Trevino－Cueto，M Luis，J C Contreras－Esquivel，et al.Gallic acid and tannase accumulation during fungal solid state culture of atannin－rich desert plant（Lanrrae tridentate Cov.）［J］.Bioresource Technology，2007，98（26）：721～724.

16 林健輝，黃曼曼，陳雪香，等.曲霉T3－5－1產(chǎn)單寧酶培養(yǎng)條件優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2010，31（19）：245～249.

17 馬如意，趙祥穎，劉建軍.單寧酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化［J］.中國釀造，2011（6）：153～155.

18 劉如石，李清明，謝達(dá)平，等.Asp.niger No.3液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶條件的研究［J］.食品科學(xué)，2001，22（2）：28～32.

19 Bratali K，Rantu B.Effect of additives on the behavioural properties of tannin acyl hydrolase［J］.Process Biochemistry，2003，38（9）：1 285～1 293.

20 游見明.黑曲霉單寧酶發(fā)酵工藝［J］.現(xiàn)代食品科技，2005，21（3）：96～101.

21 曾維麗，姚開，賈冬英，等.塔拉單寧水解酶產(chǎn)生條件的研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，18（4）：592～595.

22 Banerjee D，Pati B R.Optimization of tannase production by Aureobasidium pullulans DBS66［J］.J.Microbiol Biotech，2007，17（6）：1 049～1 053.

23 Enemuor S C，Odibo F J C.Culture conditions for the production of a tannase of Aspergillus tamarii IMI388810（B）［J］.Afr.J.Biotech，2009，8（11）：2 554～2 557.

24 Iibuchi S，MinodaY，Yamada K.Studies on tannin acly hydrolase of m icroo rganism sⅡ.A new method of determing the enzyme act ivity using the change of uitra violet absorption［J］.Agri.Bio.Chem.，1967，31（5）：513～518

25 Bradoo S Gupta，P K Saxena.Parametric optimization and biochemical regulation of extracelluar tannase from Aspegillus japonicus［J］.Process Biochemistry，1997，32（2）：135～139.

26 湯茜.真菌單寧酶的研究［D］.中山：中山大學(xué)，1999.

27 欒麗杰.分泌澀柿單寧酶的微生物篩選及其酶特性的研究［D］.西安：陜西師范大學(xué)，2007.

28 謝曉莉，劉明，邱樹毅，等.黑曲霉B0201液體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶最佳工藝條件研究［J］.中國釀造，2010（8）：30～33.

29 謝曉莉，邱樹毅，劉明，等.黑曲霉半固體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的工藝優(yōu)化［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（11）：153～155.

30 Chatterjee R，Dutta A，Banerjee R，et al.Production of tannase by solid－state fermentation［J］.Bioprocess Engineering，1996，14（3）：159～162.

31 Lekha P K，Lonsane B K.Comparative titres，location and properties of tannin acyl drolaseproduced by Aspergillus niger PLK 104in solid－state，liquid surfase and submerged fermentations［J］.Process Biochemistry，1994，29（6）：497～503.

32 Cristóbal N A，Christopher A.Induction and repression patterns of fungal tannase in solid－state and submerged cultures［J］.Process Biochemistry，2001，36（6）：565～570.

33 邱樹毅，王廣莉，保玉心，等.一種用五倍子生料固體發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶的方法：中國，200810301169［P］.2008－09－10.

34 Van de Lagemaat J，DL Pyle.Solid－state fermentation and bioremediation：development of a continious process for the production of fungal tannase［J］.Chmical Engineering Joural，2001，84（2）：115～123.

35 Barthomeuf C，Regerat F，Pourrat H.Production，purification and Characterization of a tannase from Aspergillus niger LCF8［J］.Journal of Fermentation and Bioengineering，1994，77（3）：320～323.

36 Gupta R，Bradoo S，Saxena R K.Rapid purification of extracellular tannase using polyethylene glycol－tannic acid complex［J］.Letters in Applied Microbiology，1997，24（4）：253～255.

37 Beverini M，Metche M.Identification，purifieation and physicovhemical properties of tannase of aspergillus oryzae［J］.Sciences des Aliments，1990，10（4）：807～816.

38 Hossam S，Hamdy.Purification and characterization of a newly isolated stable longlife tannase produced by F.subglutinans［J］.J.Pharm.Innov.，2008（3）：142～151.

39 倪田表，王菊芳.兩步法快速分離純化單寧酶的研究［J］.中國釀造，2010（5）：109～113.

40 王維維，邱樹毅，謝曉莉，等.胞外單寧酶純化及酶學(xué)性質(zhì)的研究［J］.食品科學(xué)，2011，32（13）：239～243.

41 Kadam K L.Reverse micelles as a bioseparation tool［J］.Microb.Technol.，1986，8（5）：266～273.

42 Giovenco S，Verheggen F.Purification of intracellular enzymes from whole bacterial cells using reversed micelles［J］.Enzyme Microb.Technol，1987，9（8）：470～473.

43 田桂玲，邢國文，葉蘊(yùn)華.在非水介質(zhì)中進(jìn)行酶促反應(yīng)的幾個(gè)重要問題［J］.有機(jī)化學(xué)，1998，18（1）：11～19.

44 陳石根，周潤琦.酶學(xué)［M］.上海：復(fù)旦大學(xué)出版社，2001.

45 Weetall H H，Detar C C.Immobilized tannase［J］.Biotechnology and Bioengineering，1974，16（8）：1 095～1 102.

46 程琦，程啟坤，李名君.單寧酶的固定化及其在酯型兒茶素水解反應(yīng)中的應(yīng)用［J］.生物化學(xué)雜志，1996，12（4）：423～426.

47 Boadi D K，Neufeld R J.Encapsulation of tannase for the hydrolysis of tea tannins［J］.Enzyme and Microbial Technology，2001，28（7～8）：590～595.

48 劉冠卉，屠潔，馬海樂，等.殼聚糖固定化單寧酶及其澄清綠茶湯的應(yīng)用研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（10）：16～169.

49 范超，黎繼烈，王揮.玉米芯固定化單寧酶的工藝條件優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2011，32（11）：123～128.

50 王揮，袁強(qiáng)，范超，等.LX－1000HA樹脂固定化單寧酶的工藝優(yōu)化［J］.食品與機(jī)械，2011，27（5）：168～171.

Advances on preparation of tannase

WANG Hui1HUANG Shou－en1，2YAN Hong3LI Ji－lie1LI Zhong－h(huán)ai1

（1.Central South University of Forestry ＆Technology，Changsha，Hunan41004，China；2.Chansha University of Science ＆Technology，Changsha，Hunan41015，China；3.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan410208，China）

Tannase is mainly prepared by Aspergillus and other microbial fermentation.The ester bonds and depside bonds in Tannin can be thydrolysis by tannase and combinat important industrial material gallic acidsand other compounds.Tannase has been widely applied in such areas as food and beverages，cosmetics and feed industries.The article reviews on the new developments about tannase－producing strains breeding，medium for fermentation system，fermentation production extraction and purification，immobilized enzyme technology of tannase，et al.and the development trend of researches on tannase preparation.

tannase；strain breeding；fermentation medium；immobilized enzyme

10.3969／j.issn.1003－5788.2012.03.067

國家“948”項(xiàng)目（編號：2012－4－17）

王揮（1974－），男，中南林業(yè)科技大學(xué)助理研究員，博士。Email：wh9469＠126.com

2012－01－30