魚類在經(jīng)絡研究中的運用和體會

中國中醫(yī)科學院針灸研究所（0000）蔣瑾 張金鈴 張璐 宋曉晶 羅明富

煤炭醫(yī)院 （100028）晉志高2Δ

河南中醫(yī)學 院（450008） 李繼偉5

近年來，斑馬魚作為一種模式生物，已經(jīng)越來越受到國內(nèi)外醫(yī)學界的重視。觀賞魚具有體積小、生殖周期短、體外受精且胚胎發(fā)育透明并且其基因與人類基因的相似度達到87%等特點。斑馬魚、錦鯉魚等觀賞魚不僅外觀漂亮，而且神經(jīng)解剖研究者通過DiA 等熒光標記[1][2][3]觀察到發(fā)亮的熒光標記物在神經(jīng)系統(tǒng)的分布規(guī)律，為針灸經(jīng)絡機理的研究提供了形態(tài)學依據(jù)。本文就斑馬魚、錦鯉魚、新月魚作為一種在針灸經(jīng)絡研究中的應用做一探討。

1 斑馬魚、錦鯉魚、新月魚簡介

1.1 斑馬魚 生長于印度、巴基斯坦、孟加拉國等淡水河流中的一種硬骨魚（鯉魚）。成年魚全長4～6cm。因全身橫向分布著褐色斑馬線而得名。對斑馬魚的研究始于20 多年前，最早從事研究的是美國Oregon大學的Streisinger[4]等。據(jù)估計，斑馬魚基因組中約有3萬個基因，不僅數(shù)目與人類接近，而且它的許多基因與人類存在一一對應關系，因斑馬魚的胚胎透明，使其受到針灸經(jīng)絡和穴位研究者的重視。

1.2 錦鯉魚 錦鯉[2]學名 Cry prinus carpiod，生物學上屬于鯉科（Cy prinidae），世界各地均有野生魚種，但以亞洲的中國和日本為多，是由食用魚改良而來的觀賞魚品種。從比較胚胎學和進化論的觀點看，人的胚胎發(fā)育早期的確有過類似魚的過程，不僅外形像魚一樣有鰓裂和尾，而且心臟也像魚一樣只有兩腔，因此，我們認為，用錦鯉作為實驗對象進行穴位和經(jīng)絡研究，有充分的生物學依據(jù)。

1.3 新月魚 成年紅色新月魚體表延縱軸方向分布著若干條褐色條紋，全長4～6cm。

DiA [4-（4-Diethylaminostyryl）-NMethylpyridinium Iodide]是一種熒光親脂染料，它是體表感受器中毛細胞的特異性標記物，同時也可以標記神經(jīng)纖維。應用DiA可以直接對處于正常生活狀態(tài)下的魚進行活體染色和標記，對動物的傷害非常小，可以最大限度地保證動物各器官組織的新鮮，具有其他熒光標記物無法比擬的優(yōu)點，并且可以及時將完整的一條魚在熒光顯微鏡下直接進行觀察，此方法不僅簡捷易操作，而且為我們能夠?qū)游锿暾剡M行經(jīng)絡觀察，提供了形態(tài)學依據(jù)。

2 斑馬魚在疾病研究中的應用

由于斑馬魚作為模式生物的眾多優(yōu)點和與脊椎動物的相似性，斑馬魚已廣泛應用于疾病的研究，包括腫瘤[5]、造血系統(tǒng)疾病、心血管疾病、眼科疾病、骨骼相關疾病、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病、藥物成癮等[6][7][8]。斑馬魚腫瘤在基因組學和組織病理等方面與人類腫瘤高度相似[9][10]。斑馬魚的應用進一步揭示了人類腎臟疾病相關基因的功能以及分子間的相互作用，這將有利于我們進一步闡明腎臟疾病發(fā)生的分 子機制[11]。隨著科學技術的日新月異，整條觀賞魚可使用尼康等光學顯微鏡直接進行觀察，從而可進一步利用轉(zhuǎn)基因技術，使綠色熒光蛋白在特異性組織或器官上表達，有利于檢測與觀察[12]。

3 斑馬魚、錦鯉魚、新月魚在針灸經(jīng)絡研究中的應用

自中國中醫(yī)科學院針灸研究所在2006年成立以來[1][2][3]，先后用DiA熒光素對斑馬魚、新月魚、錦鯉魚進行經(jīng)絡和穴位的專門研究，主要對神經(jīng)系統(tǒng)進行了細致地觀察；毛細胞是魚類體表感受器的主要細胞成分，因此，本文中的熒光標記物即體表感受器及與之相連的神經(jīng)纖維。

3.1 方法 首先將成年魚活體放入30uM DiA水溶液中3小時，之后經(jīng)10%乙醚麻醉，最后在熒光顯微鏡下觀察。

3.2 結果

3.2.1 斑馬魚體表感覺器官分布有一定的規(guī)律性：若干感覺器官聚集在一起形成簇，若干簇又有規(guī)律地沿軀體長軸排成線，類似于傳統(tǒng)經(jīng)絡與穴位。

3.2.2 在顯微鏡下，熒光標記物（錦鯉魚體表感受器）呈亮圓點狀，若干標記物聚集成簇，有規(guī)律地分布于體表各個部位。標記物在眼周圍呈放射狀，并且沿鰓蓋前后緣有線性分布；在軀體部，標記物沿身體長軸呈線性排列，錦鯉魚共約有14 條。長時間DiA浸染的錦鯉，在熒光鏡下還可辨清與感受器相連的神經(jīng)纖維走向。

3.2.3 新月魚體表感受器呈亮圓點狀，大多標記物單個分布，部分成簇分布（2～5個/簇），并且有規(guī)律地分布于體表各個部位；若干簇又有規(guī)律地沿軀體長軸排成線，類似于傳統(tǒng)經(jīng)絡與穴位現(xiàn)象。

3.3 結論 斑馬魚、錦鯉魚、新月魚體表感受器的簇狀分布及線性排列類似于中醫(yī)的穴位與經(jīng)絡，其神經(jīng)纖維趨向頭側(cè)并向體干側(cè)線管前端匯聚，在體表形成一個以神經(jīng)縱向走行為主的感覺系統(tǒng)，與經(jīng)絡的縱向傳導相似，對經(jīng)絡研究有借鑒意義。

魚類體表感受器可分為四類：感覺芽、丘狀感覺器、側(cè)線器官、羅倫甕。其中丘狀感覺器又稱陷器或神經(jīng)丘，由于其感覺細胞低于四周的支持細胞，因而形成中凹的小丘狀構造，能感覺水流和水壓。側(cè)線器官是最高度分化的、魚類及水生兩棲類生物所特有的皮膚感覺器，呈溝狀或管狀，具有感覺水流、確定方位、輔助趨流性定向、感受低頻率聲波等功能[13]。神經(jīng)丘是側(cè)線的重要組成部分，典型的神經(jīng)丘分布于魚類頭部或體干的溝槽或管道內(nèi)（如側(cè)線管），此外，也有游離分布的神經(jīng)丘，但其分布尤其是在體干部的分布規(guī)律知之甚少。由于耳支是神經(jīng)系統(tǒng)種系發(fā)生過程中魚類和兩棲類支配側(cè)線器官的最后殘留物，本研究首次應用活體熒光染色的方法觀察，了解到錦鯉體表游離神經(jīng)丘的分布規(guī)律，豐富了魚類學的內(nèi)容。

我們的實驗認為：在動物的外周組織中到處都有神經(jīng)網(wǎng)絡[14]，軀干和四肢上的膽堿脂酶陽性小，神經(jīng)束的神經(jīng)末梢形成的神經(jīng)網(wǎng)絡多分布在小血管周叢。我們采用甲苯胺藍染色法對肥大細胞[15]鏡下觀察顯示，在經(jīng)絡皮部組織內(nèi)，可見穴區(qū)真皮內(nèi)肥大細胞的分布，皮下組織內(nèi)肥大細胞存在脂肪組織中，集中于血管周圍，肥大細胞數(shù)量最多。經(jīng)典解剖學認為，迷走神經(jīng)耳支是迷走神經(jīng)末梢在周圍皮膚的分支，中樞走行中有舌咽神經(jīng)和面神經(jīng)加入，屬于一般軀體神經(jīng)，投射到三叉神經(jīng)脊束核。

經(jīng)絡理論是中醫(yī)學的基礎，數(shù)千年前中國古人就發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)存在氣血密不可分的調(diào)控系統(tǒng)[16]，并稱之為“經(jīng)絡”。經(jīng)絡由經(jīng)脈和絡脈組成，合稱經(jīng)絡；“經(jīng)”之路徑，“絡”之網(wǎng)絡，像網(wǎng)絡樣的錯綜聯(lián)結，遍及周身。

近半個多世紀以來，隨著科學尤其是生命科學的進步，我國科研工作者對經(jīng)絡、腧穴理論進行了大量的研究，證實了經(jīng)絡現(xiàn)象的客觀存在性，同時認為經(jīng)絡現(xiàn)象是普遍存在于人群之中的一種正常生命現(xiàn)象[16]，但至今仍未能發(fā)現(xiàn)經(jīng)絡和穴位存在的形態(tài)結構，現(xiàn)有的研究結果又很難完整地解釋腧穴和經(jīng)絡現(xiàn)象。鑒于穴位是一種固有的生命現(xiàn)象，低等脊椎動物亦應存在穴位或類似結構。

前期研究工作已發(fā)現(xiàn)，斑馬魚、新月魚、錦鯉魚等均存在體表感受器的簇狀分布與線性排列，類似于傳統(tǒng)的穴位與經(jīng)絡，因此，應用低等脊動物錦鯉，以其體表感受器為研究對象，進行穴位與經(jīng)絡研究，以期運用比較生物學的方法，探討穴位存在的生物學證據(jù)。

經(jīng)絡和穴位的研究一直是個熱點和難點。穴位主要功能是感覺，針刺穴位所產(chǎn)生的酸、麻、脹、痛、熱等針效均表現(xiàn)為感覺器官的反應。我們研究發(fā)現(xiàn)感覺器官在軀體的有規(guī)律的集中分布[1][2][3]，其功能上類似于穴位。最近研究發(fā)現(xiàn)感覺器官在多數(shù)魚類中具有多種功能，如感覺平衡、水流方向、速度、信息交流、群體活動、交配、捕食和逃避被捕食等，部分魚類的此類器官還可以放電和發(fā)光。中醫(yī)對經(jīng)絡的經(jīng)典描述，在軀干部分與本研究所觀察到的感覺器官所形成的線有相似之處，都形成若干條線。因此，有研究者推測，斑馬魚存在類穴位與類經(jīng)絡結構；斑馬魚皮膚感覺器官并不是均勻地分布于全身，而是若干感覺器官聚集在一起形成有規(guī)律的簇，而若干簇又有規(guī)律地沿軀體長軸排成線，類似于傳統(tǒng)經(jīng)絡與穴位。

既然透明斑馬魚等（觀賞魚類）神經(jīng)系統(tǒng)分布有規(guī)律可尋，那么，我們就有充分的理由對其機理研究進行大量的、更加深入的挖掘工作。國外對斑馬魚在遺傳基因[17]等方面研究已有相關報導。目前，在國內(nèi)將觀賞魚類用于經(jīng)絡研究還只是剛起步，今后還有大量工作等待我們?nèi)ネ瓿伞?/p>

4 展望

最近美國科學家成功培育出一種透明斑馬魚，他們稱這種透明斑馬魚可以直視魚的內(nèi)部器官，實時地觀測活體器官的生長過程。此新培育出的斑馬魚會在整個生命過程中保持通體透明。斑馬魚是目前生命科學研究中重要的模式脊椎動物之一。

自20世紀90年代初，斑馬魚因其多方面的優(yōu)點已成為醫(yī)學模式動物家族中重要的一員，受到越來越多地重視和利用，使得人類不斷發(fā)現(xiàn)一些新的研究成果。斑馬魚作為模式生物有以下優(yōu)點：斑馬魚是脊椎動物，有獨立的組織器官如腦、感受器、心臟、肝、胰、腎、腸、骨、肌肉等，且其器官與人體器官在結構、生理、分子水平等方面有著驚人的相似點；個體小，喂養(yǎng)和費用便宜，所需空間場地不大；胚胎透明，完整的活體可觀察到所有內(nèi)部器官和結構，可以避免殺死或解剖動物，從而可多角度對其進行觀察。此外，雌性斑馬魚可產(chǎn)卵200枚，胚胎在24小時內(nèi)就可發(fā)育成形，這使得生物學家可以在同一代魚身上進行不同的實驗，對于疾病機制的研究非常有益。

綜上所述，斑馬魚、錦鯉魚、新月魚的皮膚作為一種直觀感覺器官，具有其他器官無法比擬的優(yōu)勢，由于神經(jīng)系統(tǒng)是所有器官組織中最復雜的系統(tǒng)，而皮膚卻直觀可視，尤其是透明觀賞魚類不僅美觀大方，而且可以直視魚的內(nèi)部器官，也為神經(jīng)系統(tǒng)的可視性研究提供了可靠保障。我們通過對透明斑馬魚等實驗研究切實體會到，雖然存在困難和阻力，但是，它仍然具有其他實驗動物無法比擬的明顯優(yōu)勢。我們相信隨著中醫(yī)針灸事業(yè)的不斷發(fā)展，斑馬魚等將在針灸經(jīng)絡研究領域為中醫(yī)事業(yè)作出自己應有的貢獻。