豬細(xì)小病毒的研究進(jìn)展

王冠 (山東省畜牧獸醫(yī)信息中心 濟(jì)南 250022) 代小芳 謝之景 （山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 泰安）

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豬細(xì)小病毒的研究進(jìn)展

王冠 (山東省畜牧獸醫(yī)信息中心 濟(jì)南 250022) 代小芳 謝之景 （山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 泰安）

豬細(xì)小病毒病是引起母豬繁殖障礙的主要病原之一，由豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)感染引起的，可以導(dǎo)致初產(chǎn)母豬及血清學(xué)陰性的經(jīng)產(chǎn)母豬發(fā)生流產(chǎn)、不孕、產(chǎn)死胎、木乃伊胎及弱仔等。同時還可以引起仔豬非化膿性心肌炎(Bolt，1997)、皮炎癥狀(Kelly，1994)及消瘦性綜合征(Krakowka，2000)。該病廣泛存在于世界各大豬場，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的損失。

1 豬細(xì)小病毒病原學(xué)研究

1.1 PPV的形態(tài)和理化學(xué)特點 PPV屬細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，二十面體等軸立體對稱，無囊膜，直徑約20~26nm。衣殼由32個殼粒組成，核心含單股負(fù)鏈DNA。

PPV具有耐酸性和耐酶性，在pH3~9的條件下穩(wěn)定。胰酶短時間(如1h)的處理，對其感染性沒有影響，反而能提高其感染效價，這可能是由于胰酶使病毒粒子在懸液中進(jìn)一步分散的結(jié)果。PPV耐熱，56℃處理48h或70℃ 2h后仍能部分保持感染力和血凝活性，但80℃經(jīng)5min加熱即可喪失活性。Mary等(1969)的研究表明：病毒在4℃極為穩(wěn)定，可長期保存，在-20℃和-70℃下經(jīng)1年以上的保存，其感染效價和血凝性都不改變。PPV對木瓜蛋白酶、胃蛋白酶及核糖核酸酶，以及對脂溶劑如乙醚、三氯甲苯、醇和脫氧膽酸鈉均有一定的抵抗力。

對各種消毒劑有很強(qiáng)的抵抗力，甲醛蒸汽和紫外線需要相當(dāng)長的時間才能殺死PPV，0.5%漂白粉或氫氧化鈉5min可殺死PPV，2%戊二醛則需要20min左右，3%甲醛則需要2h。PPV具有血凝性，能凝集豚鼠、大鼠、小白鼠、恒河猴、貓、雞和人O型紅細(xì)胞，其中對豚鼠的紅細(xì)胞的凝集最好，不能凝集牛、倉鼠和豬的紅細(xì)胞。雞紅細(xì)胞對PPV的敏感性有個體差異，不同的生理狀況、遺傳特性和年齡會影響實驗的結(jié)果。此外，PPV的血凝活性還依賴于反應(yīng)的溫度，在4℃可以獲得最高的反應(yīng)滴度。

1.2 病毒分型 按照致病性與組織嗜性大致可分為4個類型。第1類以NADL-2株為代表，可以用作弱毒疫苗來防制PPV感染，但通過子宮接種有復(fù)制和感染的能力；第2類是以NADL-8株為代表的強(qiáng)毒株，口服接種能夠穿過胎盤屏障，造成胎兒感染，形成病毒血癥；第3類是以Kresse株為代表的皮炎型強(qiáng)毒株，可以致死免疫不充分的胎兒；第4類以AF-83株為代表的腸炎型毒株，主要引起腸道的病變。雖然存在不同的PPV毒株，但是目前認(rèn)為PPV只有一個血清型。

1.3 PPV的生長特性 PPV只能在來源于豬的細(xì)胞(如原代豬腎細(xì)胞、豬睪丸細(xì)胞和傳代系PK-15和人的某些傳代細(xì)胞(如Hela、KB、HEp-2、Lul32等細(xì)胞)中增殖，其中以原代豬腎細(xì)胞較為常用。但Vasudevacharya等(1992)報道，在犬系A(chǔ)-72細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，曾被PPV病毒污染過，且在此細(xì)胞上出現(xiàn)了明顯的變化，這可能是由于病毒在結(jié)構(gòu)基因和非結(jié)構(gòu)基因處有幾個堿基發(fā)生變異，致使局部拓?fù)鋵W(xué)發(fā)生改變而引起的。因為PPV的增殖需要細(xì)胞源DNA多聚酶，因此要獲得大量的病毒并出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，一般在多數(shù)細(xì)胞都處于細(xì)胞繁殖周期的S期，即DNA合成期時進(jìn)行病毒的接種。

此外，培養(yǎng)的溫度對PPV的生長也有一定的影響。Choi(1989)將NADL-8、NADL-2、KBSH和Kresse分別在32、37、39℃進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果：NADL-8、NADL-2在3個溫度下沒有明顯的差別；Kresse株在32℃、37℃時生長受到限制，在39℃時沒有影響。而KBSH株則正好相反，在39℃培養(yǎng)時，細(xì)胞生長受限制，而在32℃、37℃時細(xì)胞生長不受影響。體外復(fù)制溫度的差異可以解釋不同分離株在豬體內(nèi)復(fù)制能力和毒力的差異。

2 流行病學(xué)及流行狀況

2.1 流行病學(xué) 各種品系的豬及不同日齡的豬均可感染，豬以外的其他動物不易感染。據(jù)報道，在牛、貓、綿羊、豚鼠、小鼠和大鼠中均能檢測到PPV的特異性抗體，兔感染后可致其流產(chǎn)、死產(chǎn)，這表明PPV的宿主范圍在擴(kuò)大，感染譜逐漸加寬。感染的公母豬是主要的傳染源，病毒可經(jīng)胎盤傳播給胎兒，形成垂直傳播；通過消化道和呼吸道感染也是豬群感染PPV的主要方式。Lucas等(1974)在被感染的公豬的睪丸內(nèi)發(fā)現(xiàn)了PPV，并證明能通過交配傳染給母豬。

該病一般呈地方流行性或散發(fā)，在初次感染的豬場往往呈暴發(fā)性流行。由于PPV感染性強(qiáng)，且對外界環(huán)境及許多消毒劑都有一定的抵抗力，一旦侵入健康的豬群，在三個月內(nèi)，幾乎導(dǎo)致100%的感染。Fujiska等(1975)報道：在該病發(fā)生后的豬場，能持續(xù)幾年甚至十幾年不斷出現(xiàn)生殖失敗。

2.2 流行狀況 PPV在世界各地的豬群中普遍存在，近年來，隨著規(guī)?；B(yǎng)豬的發(fā)展，PPV的感染呈現(xiàn)擴(kuò)大的趨勢，目前，想要尋找到PPV陰性的豬群已經(jīng)比較困難。

從60年代中期分離病毒并逐步確定其致病性以來，相繼已在比利時(1967)、德國(1968)、日本(1972)、美國(1972)、荷蘭(1972)、澳大利亞(1973)、南非(1975)、芬蘭(1979)、法國(1977)及加拿大(1978)、巴拿馬(1987)等國相繼報道(賴笑嫻，2010)。1982年由中國獸藥監(jiān)察所首次在國內(nèi)分離到該病毒。此后在上海(潘雪珠等，1983)、吉林(侯世寬等，1983)、四川(鄔捷等，1985)等地都分離到PPV。

3 PPV的診斷與防制

3.1 診斷 可根據(jù)臨床癥狀和流行病學(xué)做出初步的診斷。一般認(rèn)為，如果僅妊娠豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、胎兒發(fā)育異常，同時有證據(jù)表明是傳染性疾病時，則應(yīng)考慮到PPV感染的可能。但進(jìn)一步確診必須進(jìn)行實驗室診斷(朱潤芝，2005)。病毒分離和鑒定是PPV感染最為確切的診斷方法。通常采取可疑的流產(chǎn)和死產(chǎn)胎兒的腎、肺、肝、腦、睪丸和胎盤等，其中以腸系膜淋巴結(jié)和肝臟的分離率最高(殷震，1997)。但是此方法費時費力，并且需要一定的技術(shù)條件和設(shè)備，從而限制其在臨床上的應(yīng)用。血清學(xué)檢測方法主要有血凝(HA)和血凝抑制試驗(HI)，該法操作簡單，但靈敏度低，只能作為輔助診斷的方法；血清中和試驗(SN)的特異性高于HI，但其操作時間長，用于臨床的時效性太差；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的實驗結(jié)果與HI一致且可用于毒大量的血清進(jìn)行檢測，具有省時、準(zhǔn)確的優(yōu)點；乳膠凝集試驗適用于臨床上的現(xiàn)場檢測，有良好的應(yīng)用前景；免疫熒光抗體技術(shù)(FAT)是一種精確性的技術(shù)，但存在非特異性染色的問題；對流免疫電泳具有簡便、快速、穩(wěn)定的特點，有一定的推廣價值；此外還有銀加膠體金技術(shù)(SECGA)、瓊脂擴(kuò)散試驗、免疫電鏡試驗等。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，已經(jīng)建立了許多更加敏感的診斷方法。核酸探針技術(shù)、PCR技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)等都具有快速、特異性強(qiáng)及靈敏度高等特點。綜上所述，豬細(xì)小病毒病的診斷方法很多。相對而言，目前臨床上應(yīng)用較多的是血清學(xué)診斷技術(shù)，特別是HA和HI試驗，這兩種方法基本能滿足常規(guī)的病原檢測和血清流行病學(xué)調(diào)查等需要。但要確診還需利用病毒分離鑒定方法。而分子生物學(xué)診斷方法靈敏度高、特異性好，檢測快速，結(jié)果可靠，隨著條件的完善，將會得到更廣泛的應(yīng)用。

3.2 防制 同其他的許多病毒病一樣，該病目前還沒有有效的治療方法，主要以預(yù)防為主。由于PPV的血清型單一及其具有高免疫原性，使得疫苗接種成為控制PPV感染的一種行之有效的方法，于繁殖前給母豬接種疫苗是世界上大部分地區(qū)共用的方法。（1）疫苗：常用的弱毒疫苗主要有NADL-2弱毒株(Mengeling，1986)、HT變異株(Fujisakl，1982)、HT-SK-C株(Akihiro，1986)、N株(蔣玉雯等，1992)等。在國外多用NADL-2株，在國內(nèi)主要用N株。此外，葉向陽等(1996)將PPV通過ST細(xì)胞上連續(xù)傳代獲得弱毒株，經(jīng)安全性試驗證實該毒株有良好的安全性及制成的疫苗有良好的免疫性。雖然已有多株弱毒疫苗在臨床上得到了應(yīng)用，但存在病毒重組及弱毒返強(qiáng)的危險，使得弱毒苗的應(yīng)用受到一定的限制。而滅活疫苗一直被認(rèn)為是研制周期最短、最為安全可靠的疫苗。自1976年國外就有關(guān)于PPV滅活疫苗的研究報道，20世紀(jì)80年代在美國、法國、澳大利亞等國家已普遍應(yīng)用。在我國，潘雪珠(1983)等學(xué)者也成功研制出PPV滅活疫苗。PPV疫苗研制中常用的滅活劑有福爾馬林、?丙內(nèi)酯(?-PL)、N-乙酰乙烯亞胺(AEI)及二乙烯亞胺(BEI)等；常用的佐劑有氫氧化鋁和油水乳劑。由于聯(lián)苗可以簡化免疫程序，降低臨床應(yīng)激反應(yīng)，適合規(guī)?；B(yǎng)豬生產(chǎn)的發(fā)展趨勢，現(xiàn)有的滅活聯(lián)苗有PPV-PRV(Mengeling，1980；鄔捷等，1988；)、PPV-JEV(姜天童等，1996)等，動物實驗均表明兩種病毒抗原同時刺激機(jī)體時未發(fā)生干擾作用。盡管PPV的弱毒苗和滅活苗在豬細(xì)小病毒病的預(yù)防控制中起到了十分重要的作用，但均存在不同程度的缺陷。如弱毒疫苗有發(fā)生重組及毒力返強(qiáng)的潛在威脅；而滅活疫苗有產(chǎn)生抗體的時間較長，免疫效果不穩(wěn)定等。因此，尋找更為安全有效的疫苗一直是學(xué)者們的研究熱點。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展給新型的PPV疫苗的研制和開發(fā)提供了良好的契機(jī)，主要有基因工程亞單位疫苗、基因工程多價亞單位疫苗、基因疫苗、以病毒為載體的重組活疫苗、轉(zhuǎn)基因植物可飼(食)疫苗等。（2）目前我國已經(jīng)取得新獸藥證書的PPV疫苗有：上海農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所研制的PPV油乳劑滅活疫苗(三大類新獸藥，(94)新獸藥證字第04號)，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司、中牧實業(yè)股份有限公司聯(lián)合研制的PPV滅活疫苗(WH-1株)(三大類新獸藥，(2006)新獸藥證字第71號)，.農(nóng)業(yè)部2005年4月統(tǒng)一核發(fā)文號之前，各地取得PPV疫苗的文號有6個(桂生藥字(2003)191138；皖生藥字(2001)111138；農(nóng)生藥字(2001)561138；黑生藥字(2002)071138；遼生藥字(2001)051138和晉生藥字(2002)031138)(占利賓，2009)。（3）PPV疫苗的免疫程序：PPV的免疫主要以體液免疫為主，Mary和Cartwright報道，人工接種后6~9d，豬血清中即有抗體出現(xiàn)，14~21d抗體滴度達(dá)到1:1024~4096，大于70d的胚胎感染PPV，也可產(chǎn)生同樣高效價的抗體。仔豬出生后，隨年齡的增長而逐漸下降，到6~8月齡已檢測不到抗體，此時的初產(chǎn)母豬最容易感染PPV(黃秋月，2003)。Paul(1986)等發(fā)現(xiàn)豬群在接種PPV滅活苗時，母源抗體水平低的豬與血清學(xué)陰性豬的免疫應(yīng)答一樣，而中等水平的母源抗體對疫苗免疫有輕微的干擾作用，高效價抗體對疫苗有明顯的干擾作用。呂建強(qiáng)等(2002)進(jìn)行了PPV母源抗體對滅活疫苗免疫效果影響的研究，結(jié)果證實不論母源抗體水平高低均不會明顯抑制疫苗的主動免疫反應(yīng)，但是主動免疫的抗體反應(yīng)規(guī)律與豬體內(nèi)的母源抗體的效價有關(guān)系。在母源抗體滴度大于1:149.5時，滅活疫苗接種后抗體水平先降后升，升幅為1~3倍；而母源抗體小于1:25.6時，主動免疫抗體一直持續(xù)上升，母源抗體陰性豬的抗體增幅最大。免疫接種的最佳時間是在初產(chǎn)母豬懷孕前的幾周內(nèi)進(jìn)行，以便在懷孕的整個敏感期都產(chǎn)生免疫力。對于初產(chǎn)母豬的免疫接種的時機(jī)多為5~6月齡，此時母源抗體已基本消失，不會干擾主動免疫的形成，如不急于配種，最好可延至7月齡免疫，因為有少量的后備母豬的母源抗體消失的速度較慢，但母源抗體一般不會超過7月齡(趙以云，2009)。

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（2011–09–27）

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