麻鴨源性鮑氏不動桿菌的分離與鑒定

吳 白 劉丹丹 陳 玉 王彥紅 劉文博 （揚州大學(xué)動物醫(yī)院 江蘇 揚州 225009）

鮑氏不動桿菌是一種不發(fā)酵糖類、氧化酶陰性、硝酸鹽還原陰性、不能運動的革蘭氏陰性桿菌，是人類和動物皮膚、呼吸道和胃腸道常見的條件致病菌[1]。隨著抗菌藥物的不合理使用，細(xì)菌對抗生素的耐藥性尤其是多重藥物耐藥性嚴(yán)重地危及著抗感染疾病的治療[2,3]。本試驗從麻鴨的肝臟內(nèi)分離到一株革蘭氏陰性短桿菌并進(jìn)行了藥敏試驗。

1 材料與方法

1.1 發(fā)病情況 2011年8月?lián)P州高郵某農(nóng)戶，帶來3只50日齡麻鴨到揚州大學(xué)動物醫(yī)院就診，共飼養(yǎng)100只，已死亡20只。麻鴨病程3d左右，于35日齡時注射H5N2禽流感病毒疫苗。病死麻鴨剖檢發(fā)現(xiàn)：肝、氣囊、心表面有纖維性滲出物附著；肝脂肪變性；脾紋理明顯腫大；心肌刷狀壞死、出血；腸道有較多環(huán)狀壞死。

1.2 細(xì)菌分離 取麻鴨的肝組織在無菌環(huán)境下接種于LB瓊脂平板上，經(jīng)37℃24h培養(yǎng)后，觀察結(jié)果。在LB瓊脂平板和麥康凱培養(yǎng)基上繼續(xù)純培養(yǎng)，觀察LB瓊脂平板和麥康凱培養(yǎng)基上細(xì)菌的生長狀況。挑取單個致病菌落進(jìn)行革蘭氏染色，然后鏡檢。

1.3 生化試驗 利用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管對所分離菌株進(jìn)行生化指標(biāo)測定[4］。37℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。

1.4 藥敏試驗 采用紙片瓊脂擴(kuò)散法，藥敏紙片購于杭州微生物試劑有限公司，操作方法和判定標(biāo)準(zhǔn)參照該公司操作方法與標(biāo)準(zhǔn)。藥敏紙片有：痢特靈300μg/片，丁胺卡那霉素30μg/片，羅美沙星10μg/片，強(qiáng)力霉素30μg/片，氯霉素30μg/片，左氟沙星5μg/片，慶大霉素10μg/片，卡那霉素30μg/片，氟哌酸10μg/片，萘啶酸30μg/片，菌必治30μg/片，鏈霉素10μg/片，復(fù)方新諾明1.25/23.75μg/片，多粘菌素B300U/片，美洛西林75μg/片。

1.5 小鼠致死實驗 待檢菌株用LB平板37℃培養(yǎng)24h，在 平板中注入無菌生理鹽水，吸取稀釋液腹腔接種6周齡ICR小鼠2只，一只0.15ml，另一只0.2ml，觀察24～72h，同時對死亡小鼠分離菌株。

1.6 16S rDNA基因測序法 將分離菌采用煮沸裂解法制備細(xì)菌基因組DNA模板，按照16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(寶生物工程(大連)有限公司)方法操作，PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定后，用Agarose Gel DNA Extraction Kit(Roche公司)回收，回收產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序；將測定的序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST搜索比對，鑒定細(xì)菌種屬。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌鏡檢 在LB瓊脂平板上形成淡黃色圓形菌落，在麥康凱培養(yǎng)基上生長，菌落呈淡粉紅色。革蘭氏染色的鏡檢結(jié)果為革蘭氏陰性短桿菌，散在出現(xiàn)，兩端鈍圓。

2.2 生化試驗結(jié)果 細(xì)菌在37℃培養(yǎng)24h后，生化試驗結(jié)果顯示分離菌株不能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖等糖類，氧化酶陰性、硝酸鹽還原陰性，生化結(jié)果符合鮑氏不動桿菌的特點。

2.3 藥敏結(jié)果 藥敏試驗參照藥敏試驗判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示高度敏感的藥物有丁胺卡那霉素、卡那霉素、慶大霉素；對痢特靈、左氟沙星、氯霉素、羅美沙星中度敏感；對強(qiáng)力霉素、氟哌酸、萘啶酸、菌必治、鏈霉素、復(fù)方新諾明、多粘菌素B、美洛西林等耐藥。

2.4 小鼠致死效果 細(xì)菌稀釋液腹腔接種2只6周齡ICR小鼠24h后都死亡，在無菌環(huán)境下對死亡老鼠的肝臟做觸片進(jìn)行美藍(lán)染色。注入0.15ml細(xì)菌稀釋液的老鼠肝臟邊緣變黑，在顯微鏡下可見桿狀細(xì)菌散在或成對出現(xiàn)。另一只注射0.2ml的老鼠肝臟已大部分變黑，做觸片美藍(lán)染色后亦可見較多的桿狀細(xì)菌。

2.5 基因測序結(jié)果 通過因特網(wǎng)在NCBI 的Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中對分離菌株測序結(jié)果進(jìn)行檢索。結(jié)果顯示此細(xì)菌是鮑氏不動桿菌。

3 討論

（1）從病死鴨分離到一株細(xì)菌，因為此細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生化特性等較少見，應(yīng)用16S rDNA基因測序法快速鑒定分離菌顯示為鮑氏不動桿菌，確定分離菌后對照其細(xì)菌培養(yǎng)、生化特性等亦符合鮑氏不動桿菌的生物學(xué)特性。由于細(xì)菌菌株的16S rRNA基因分子結(jié)構(gòu)上的高度保守性、分布的普遍性及其所含的大量信息，使16S rRNA基因成為了公認(rèn)的細(xì)菌分類指標(biāo)[5]，因而將測定細(xì)菌的16S rRNA 基因進(jìn)行序列分析，運用于細(xì)菌的鑒定。16S rDNA序列分析是目前較好的快速而直接的檢測微生物的分子生物技術(shù)的方法之一，已經(jīng)被廣泛使用[6]。（2）鮑氏不動桿菌廣泛分布于自然界、存在于土壤、飲水、污水及食品中。鮑氏不動桿菌是不動桿菌在臨床感染病例中出現(xiàn)率最高的，感染區(qū)域多在醫(yī)院，最主要的是由于呼吸道感染[1]。鮑氏不動桿菌在人感染上已有較多報導(dǎo)[7,8]，在動物上的較少。鮑氏不動桿菌在環(huán)境中大量存在，抵抗力較強(qiáng)，并且對抗生素有廣泛的抗性，在水中繁殖被麻鴨攝入體內(nèi)造成麻鴨感染。鑒于藥物在集約化養(yǎng)殖中使用日益廣泛，鮑氏不動桿菌對動物致病的機(jī)會也日益增多，應(yīng)予重視[9]。（3）鮑氏不動桿菌極易產(chǎn)生耐藥性，藥敏試驗結(jié)果顯示本次分離菌株對丁胺卡那霉素、卡那霉素、慶大霉素敏感，對多數(shù)抗菌素是耐藥的，如對菌必治，美洛西林等頭孢菌素類藥物耐藥，與許慧等報道結(jié)果相符[10]。因此需加強(qiáng)養(yǎng)殖戶對預(yù)防鮑氏不動桿菌感染的知識，同時對養(yǎng)殖戶進(jìn)行濫用抗生素帶來的危害等知識普及，使抗生素的使用更加合理化、科學(xué)化。針對藥敏試驗結(jié)果可選用其中一種敏感藥物拌飼投喂，并定期對麻鴨生活的水環(huán)境進(jìn)行消毒，改善水質(zhì)以減少病原菌。

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