抗菌肽的分子設(shè)計研究進展

蘇慶紅，許曉群，王郡甫

（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 山東省現(xiàn)代醫(yī)用藥物與技術(shù)重點實驗室，山東 濟南 250062）

抗菌肽的分子設(shè)計研究進展

蘇慶紅，許曉群，王郡甫

（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 山東省現(xiàn)代醫(yī)用藥物與技術(shù)重點實驗室，山東 濟南 250062）

抗菌肽因其具有廣譜高效的抗菌特性，且不易引起耐藥性，成為最有潛力的肽類抗生素。為使抗菌肽更加高效、低毒，需對天然抗菌肽進行分子設(shè)計改造。就影響抗菌肽抗菌活性的相關(guān)因素和分子設(shè)計方法等方面的研究進展進行了綜述。

抗菌肽；抗菌活性；分子設(shè)計

抗菌肽（Antimicrobial peptides）是生物體在外界病原微生物入侵時產(chǎn)生的具有抗菌活性的多肽物質(zhì)，通常由12～45個氨基酸組成，分子量約40 k D，是生物體非特異性免疫的重要組成部分?？咕囊患壗Y(jié)構(gòu)具有典型特征，即N端富含Lys和Arg等極性氨基酸，而C端富含Ala、Val和Gly等非極性氨基酸，中間部分富含Pro，因此抗菌肽主要以陽離子形式存在。到目前為止，抗菌肽數(shù)據(jù)庫所收集的抗菌肽種類已經(jīng)超過1900種，主要來源于原核生物和真核多細(xì)胞生物［1］。

1 對抗菌肽進行分子設(shè)計的目的

抗菌肽除了具有快速、廣譜、高效的殺菌特性外，還不會引起致病菌抗藥性的增強，而且能殺滅部分耐藥性致病菌。因此，抗菌肽自發(fā)現(xiàn)以來就被認(rèn)為是傳統(tǒng)抗生素的最佳替代品。然而，天然抗菌肽并非完美無缺，大部分天然抗菌肽的抗菌活性不高，部分抗菌肽在與細(xì)胞膜相互作用的過程中對真核細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞毒性也限制了抗菌肽在臨床上的應(yīng)用［2］。因此，提高其抗菌活性、降低毒性是抗菌肽分子設(shè)計改造的主要目的。

抗菌肽分子設(shè)計是基于抗菌肽的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，通過一系列生物信息學(xué)方法，實現(xiàn)對天然抗菌肽的定向改造或全新設(shè)計，以獲得更加符合人們需要的抗菌肽類抗生素。

抗菌肽根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點主要分為3類：線性α－兩親螺旋肽、富含Pro的線性肽、β－折疊抗菌肽［3］。其中，線性α－兩親螺旋肽結(jié)構(gòu)簡單，分布廣，數(shù)量多，而且抗菌譜廣，對G＋菌、G－菌、真菌和原生動物具有不同的抗菌活性［4］。α－螺旋結(jié)構(gòu)在抗菌肽發(fā)揮抗菌作用的過程中十分重要：它們聚集起來在細(xì)胞膜上形成穿孔或通道，誘導(dǎo)大量的細(xì)胞膜裂解，導(dǎo)致細(xì)胞失活［5］。因此，抗菌肽的結(jié)構(gòu)與功能研究以及分子設(shè)計大部分集中于線性α－兩親螺旋抗菌肽。

2 影響抗菌肽抗菌活性的因素

抗菌肽的抗菌活性主要由其分子結(jié)構(gòu)所決定。研究表明：抗菌肽的α－螺旋結(jié)構(gòu)、兩親性結(jié)構(gòu)、正電荷數(shù)、特殊結(jié)構(gòu)（特殊殘基、鉸鏈結(jié)構(gòu)）以及細(xì)菌細(xì)胞膜的組織結(jié)構(gòu)等都是影響其抗菌活性的重要因素。

2.1α－螺旋結(jié)構(gòu)

α－螺旋結(jié)構(gòu)是一類極好的水脂兩親結(jié)構(gòu)，存在于許多膜蛋白、信號肽和其它具有膜識別功能的蛋白中，是組成蛋白質(zhì)最豐富的二級結(jié)構(gòu)［6］，也是抗菌肽破壞、裂解細(xì)胞的主要結(jié)構(gòu)。典型的α－螺旋結(jié)構(gòu)近似于圓柱形，圓柱形縱軸的一面為帶正電荷的極性面即親水區(qū)，另一面為非極性面即疏水區(qū)。由抗菌肽數(shù)據(jù)庫可知，具有α－螺旋結(jié)構(gòu)的抗菌肽已超過290種［1］。

為了提高抗菌肽的抗菌活性并降低其溶血性，馬清泉等［7］采用螺旋輪投影法設(shè)計了16個氨基酸長度的肽VGR16，其中8個Val分布于螺旋輪的非極性面，5個Arg分布在極性面?？咕鷮嶒烇@示VGR16具有快速殺菌的作用，而且該肽在較高濃度時未見溶血活性，對哺乳動物幾乎沒有細(xì)胞毒性。

實驗證明抗菌肽序列中α－螺旋結(jié)構(gòu)對其抗菌活性具有重要的作用。但是單純添加α－螺旋結(jié)構(gòu)并不一定能提高抗菌活性，可能與氨基酸的疏水性和形成α－螺旋結(jié)構(gòu)的構(gòu)象有一定的關(guān)系［8］。對天蠶素A的2個α－螺旋區(qū)分別進行表達(dá)和聯(lián)合表達(dá)顯示，抗菌肽的抗菌活性不僅與α－螺旋的數(shù)量有關(guān)，還和其它因素如正電荷數(shù)和疏水性等有關(guān)［9］。

另外，研究者還對線性α－螺旋肽的環(huán)化作用進行了研究。Oren等［10］對線性兩親α－螺旋肽及其非對映異構(gòu)體以及兩者的環(huán)化物進行了結(jié)構(gòu)與功能的研究。他們選擇疏水性和所帶正電荷數(shù)都相同的氨基酸序列，用對α－螺旋形成具有不同傾向的類似物來檢驗線性化和環(huán)化對α－螺旋的形成、生物學(xué)功能、膜的連接和滲透的作用。結(jié)果表明：環(huán)化物對G＋菌和G－菌都有生物學(xué)抗菌活性，比線性肽的抗菌譜更廣，而且環(huán)化作用提高了抗菌肽在細(xì)菌和人類紅細(xì)胞之間的選擇性，環(huán)型抗菌肽的溶血性更低。

2.2 兩親性結(jié)構(gòu)

兩親性是抗菌肽具備抗菌活性的重要結(jié)構(gòu)特征。兩親性結(jié)構(gòu)有利于抗菌肽與細(xì)胞膜的結(jié)合，親水性和疏水性氨基酸分別排布在α－螺旋結(jié)構(gòu)的兩側(cè)，形成明顯的親水面和疏水面；或者分別集中在α－螺旋的N端或C端，形成明顯的親水端和疏水端。由于α－螺旋具有兩親性，所以抗菌肽分子通過膜內(nèi)分子間的位移而聚集在一起，從而在膜上形成離子通道，使細(xì)菌因不能保持正常的滲透壓而死亡［11］。

實驗證實增強兩親α－螺旋非極性面的疏水性能提高抗菌活性。Chen等［12］以含26個氨基酸殘基的兩親性α－螺旋抗菌肽V13KL作為結(jié)構(gòu)框架，研究了抗菌肽的疏水性對其抗菌活性的影響。在V13KLα－螺旋的非極性面上以疏水性更強的Leu代替Ala以增強疏水性或者將Leu換成Ala以減弱疏水性?？咕鷮嶒灲Y(jié)果表明，疏水性對抗菌肽的抗菌活性有兩種影響：在疏水性水平相對較低的階段，增強肽的疏水性達(dá)到最優(yōu)疏水性時能使抗菌活性得以改善；然而，超出最優(yōu)疏水性后會導(dǎo)致抗菌活性的明顯喪失。這可能是因為，過強的疏水性會使多肽自我凝聚的能力增強，使溶液中能夠有效發(fā)揮作用的抗菌肽分子減少。

疏水性片段的鏈長對抗菌活性也有影響：如對于蜂毒肽C末端片段的反序肽，為保持其較高的抗菌活性，疏水性片段的殘基數(shù)最少為8個［13］。

研究發(fā)現(xiàn)，肽的疏水性影響著孔道形成率、孔徑大小和孔道穩(wěn)定性，同時還影響到肽脂的作用模式。疏水性的強弱和疏水性氨基酸在肽鏈中的位置有關(guān)［14］。通過對一系列α－螺旋抗菌肽進行結(jié)構(gòu)分析顯示：抗菌肽是否具有溶血活性取決于N端結(jié)構(gòu)域的組織方式，通過設(shè)計特定位點的突變可消除抗菌肽的溶血活性［15］。

2.3 正電荷數(shù)

抗菌肽的正電荷被認(rèn)為是其結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞外膜的基礎(chǔ)。帶正電荷的抗菌肽通過靜電作用結(jié)合到帶負(fù)電的細(xì)菌磷脂膜上，然后在細(xì)菌細(xì)胞膜上形成離子通道或者裂解細(xì)胞膜，進而殺死細(xì)菌。

極性面的凈正電荷對抗菌肽的抗菌和溶血活性很重要。雜合肽CP－P是由天蠶素、蜂毒肽和蛙皮素的序列片段雜合而成，將CP－P第16位的Leu換成Ser得到含7個凈正電荷的S16，再將S16極性面第11位的Ser換成Lys得到含8個凈正電荷的K11，K11的活性明顯提高，其最小抑菌濃度（MIC）降至S16的一半，而治療指數(shù)上升為S16的兩倍［16］。

還有研究者探究凈正電荷和帶正電荷殘基對LV13K極性面的生物活性的影響發(fā)現(xiàn)，在L－V13K的極性面增加一個正電荷后其溶血活性會發(fā)生突然性的變化。當(dāng)正電荷從8增加到9時，溶血活性提高了32倍。表明一旦α－螺旋上的凈正電荷數(shù)超出最優(yōu)范圍之后，抗菌肽的溶血活性對凈正電荷的增減非常敏感［17］。

進行分子設(shè)計時，為使抗菌肽具有一定的抗菌潛力和廣度，凈正電荷數(shù)一般控制在3～9較為合適［4］。但實驗也證明單純增加正電荷并不一定能提高抗菌肽的抗菌活性［8］。

2.4 特殊結(jié)構(gòu)

2.4.1 殘基替換

殘基替換是結(jié)構(gòu)與功能研究常用且有效的方法，對于克服天然抗菌肽的毒性效果較理想。常用的殘基替換包括以D－氨基酸替換L－氨基酸、以極性氨基酸替換非極性氨基酸和特殊殘基等。

氨基酸的構(gòu)型對某些抗菌肽的活性有重要影響。傅立葉變換衰減全反射紅外光譜研究表明，沿著抗菌肽的主鏈并入33%的D－氨基酸，能夠促進肽鏈產(chǎn)生占主導(dǎo)地位的螺旋結(jié)構(gòu)。研究還發(fā)現(xiàn)那些結(jié)合了D－氨基酸的抗菌肽被環(huán)化以后抗菌活性會提高，有助于開發(fā)新型抗菌肽［10］。以極性氨基酸殘基Ser替代位于雜合肽CP－P非極性面的非極性氨基酸殘基Leu后，治療指數(shù)上升，說明極性氨基酸對非極性氨基酸的替換能夠影響兩親性進而在一定程度上影響抗菌活性，這對于未來抗菌肽的研發(fā)意義重大［16］。以Trp替代含21個氨基酸殘基的多肽（KAAKKAA）3不同位置上的Ala，若將Trp定位在陽離子區(qū)的對面則該肽不表現(xiàn)抗腫瘤活性；若將2～3個Trp定位于陽性面的鄰近位置，則該肽表現(xiàn)出對真核細(xì)胞高度的溶血活性［18］。

2.4.2 鉸鏈結(jié)構(gòu)

鉸鏈結(jié)構(gòu)對某些抗菌肽的活性是必不可少的，它的存在有助于抗菌肽的疏水端插入細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層。雜合肽CA（1－8）－MA（1－12）（CA－MA）具有鉸鏈區(qū)Gly－Ile－Gly，鉸鏈區(qū)被刪除后的類似物對細(xì)菌和腫瘤細(xì)胞的裂解活性明顯降低，說明鉸鏈區(qū)對CAMA的抗菌活性至關(guān)重要［19］。

2.5 細(xì)菌細(xì)胞膜的組織結(jié)構(gòu)

細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和組分也是抗菌肽分子設(shè)計需要考慮的因素之一。采用固態(tài)氫譜法研究兩親性α－螺旋模型肽MSI－103的活性與膜結(jié)構(gòu)的排列方式之間的關(guān)系，結(jié)果顯示：對于具備飽和鏈的液體結(jié)晶磷脂酰膽堿細(xì)胞膜來說，隨著多肽濃度的增大，兩親性α－螺旋在膜表面的定位由與膜緊密結(jié)合的S型變?yōu)閮A斜的易于侵入的T型；而對于不飽和鏈的磷脂酰膽堿細(xì)胞膜來說，在任意濃度時兩親性α－螺旋均呈現(xiàn)S型狀態(tài)。與S型相比，T型更有助于多肽透過細(xì)胞膜［20］。

3 抗菌肽分子設(shè)計的方法

3.1 應(yīng)用序列模板設(shè)計抗菌肽

大部分抗菌肽N端具有α－螺旋結(jié)構(gòu)域，并且第1位上Gly存在的比例大于70%，第8位上Lys存在的比例大于50%。Tossi等［4］廣泛收集抗菌肽自建數(shù)據(jù)庫，并且參考電荷、極性和疏水性殘基的特點給出了一個典型的兩親性α－螺旋肽的序列模板：ghhp＋hxpxh＋phh＋xhhxh。該模板在一定程度上總結(jié)了多樣性的抗菌肽序列，為抗菌肽的分子設(shè)計提供了參考。

3.2 基于地毯機制設(shè)計抗菌肽

基于地毯機制設(shè)計的抗菌肽的非對映異構(gòu)體既包含D－氨基酸又包含L－氨基酸，是新型的非溶血性抗菌肽。由于新設(shè)計的非對映異構(gòu)體在抗菌活性方面顯示出優(yōu)于天然L－氨基酸多肽的特征，因此它們有望發(fā)展成為臨床上進行體內(nèi)外治療的藥物［21］。

3.3 截取天然抗菌肽的部分序列

天然抗菌肽的所有氨基酸序列并非都是必須存在的，而且肽鏈的位置不同功能也不相同。有目的地選取肽鏈的特殊部位并且刪除無關(guān)緊要的序列，從而獲取有效的短小肽鏈?zhǔn)强咕姆肿釉O(shè)計的常用方法。研究者截取天蠶素CA19的部分肽鏈并在大腸桿菌中高效表達(dá)，抗菌實驗顯示該肽鏈具有較強的抑菌活性［22］。還有研究者截取抗菌肽Lactoferrin的不同部位，發(fā)現(xiàn)僅保留N端的10個氨基酸殘基就能保留其抗菌活性［23］。

3.4 雜合肽的設(shè)計

將不同肽鏈的優(yōu)點聯(lián)合起來可望開發(fā)出功能更加完善和高效的新型抗菌肽。例如Cecropin A抗細(xì)菌的能力強，而Magainin 2抗真菌的能力強，選取兩者N端部分氨基酸殘基制成雜合肽Cecropin A（1－8）－Magainin 2（1－12）后，抗菌活性更強且沒有溶血活性［24］。

3.5 其它設(shè)計方法

除以上4種方法以外，還有一些設(shè)計抗菌肽的新型方法，例如設(shè)計反序肽［13］、設(shè)計多拷貝的串聯(lián)重復(fù)序列［18］等。

4 展望

現(xiàn)代醫(yī)藥面臨著病原菌耐藥性提高的難題，急需開發(fā)各類抗真菌、抗病毒、抗腫瘤的新型藥物。目前，抗菌肽在醫(yī)藥上主要應(yīng)用于局部治療，由于其合成藥劑發(fā)揮作用的使用量在體內(nèi)接近毒性劑量，因此，其系統(tǒng)使用還處于臨床前的研究階段［25］?？咕淖鳛橹委熂?xì)菌感染等的藥物來源已經(jīng)得到認(rèn)可，為得到更加高效、低毒的抗菌肽，其分子設(shè)計研究也處在快速發(fā)展階段。分子設(shè)計研究為揭示抗菌肽的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系提供了突破口，為開發(fā)安全高效的臨床藥物提供了可行的途徑。然而，現(xiàn)有研究結(jié)果也顯示：影響抗菌肽抗菌活性的許多參數(shù)是緊密相關(guān)的，改變其中一個參數(shù)可能會引起其它參數(shù)的重大變化［26］。因此，開發(fā)理想的抗菌肽還需要繼續(xù)進行深入研究。

［1］ http：／／aps.unmc.edu.／AP／about.php［Z］.

［2］ Huang Y，Huang J，Chen Y.Alpha－h(huán)elical cationic antimicrobial peptides：Relationships of structure and function［J］.Protein Cell，2010，1（2）：143－152.

［3］ Kamysz W，Okrój M，Lukasiak J.Novel properties of antimicrobial peptides［J］.Acta Biochim Pol，2003，50（2）：461－469.

［4］ Tossi A，Sandri L，Giangaspero A.Amphipathic，alpha－h(huán)elical antimicrobial peptides［J］.Biopolymers，2000，55（1）：4－30.

［5］ Giangaspero A，Sandri L，Tossi A.Amphipathicα－h(huán)elical antimicrobial peptides［J］.Eur J Biochem，2001，268（21）：5589－5600.

［6］ Qi Y，Liang H，Han X，et al.Sequence preference ofα－h(huán)elix N－terminal tetrapeptide［J］.Protein Pept Lett，2012，19（3）：345－352.

［7］ 馬清泉，董娜，曹艷萍，等.利用精氨酸和纈氨酸設(shè)計新型α－螺旋抗菌肽［J］.微生物學(xué)報，2011，51（3）：346－351.

［8］ 李國棟，錢承軍，陸敏，等.一組人工合成抗菌肽的研究［J］.微生物學(xué)報，2006，46（3）：492－495.

［9］ 楊細(xì)媚，文陽安，萬祥輝，等.基于序列分析的天蠶素A串連融合表達(dá)載體的構(gòu)建［J］.生物技術(shù)通報，2009，（1）：76－79.

［10］ Oren Z，Shai Y.Cyclization of a cytolytic amphipathic alpha－h(huán)elical peptide and its diastereomer effect on structure，interaction with model membranes，and biological function［J］.Biochemistry，2000，39（20）：6103－6114.

［11］ 洪奇華，陳安國.抗菌肽研究進展［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2001，（4）：31－32.

［12］ Chen Y，Guarnieri M T，Vasil A I，et al.Role of peptide hydrophobicity in the mechanism of action ofα－h(huán)elical antimicrobial peptides［J］.Antimicrob Agents Chemother，2007，51（4）：1398－1406.

［13］ 陳素霞，孫學(xué)軍，李順子，等.蜂毒肽C末端片段的反序肽的抗菌活性和溶血活性［J］.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2005，26（12）：2233－2236.

［14］ Tachi T，Epand R F，Epand R M，et al.Position－dependent hydrophobicity of the antimicrobial magainin peptide affects the mode of peptide－lipid interactions and selective toxicity［J］.Biochemistry，2002，41（34）：10723－10731.

［15］ Polyansky A A，Vassilevski A A，Volynsky P E，et al.N－Terminal amphipathic helix as a trigger of hemolytic activity in antimicrobial peptides：A case study in latarcins［J］.FEBS Lett，2009，583（14）：2425－2428.

［16］ Huang Jin－jiang，Lu Jin－chun，Lu Min，et al.The design and con－struction of K11：A novelα－h(huán)elical antimicrobial peptide［J］.Int J Microbiol，2012，2012：764834－764839.

［17］ Jiang Z，Vasil A I，Hale J D，et al.Effects of net charge and the number of positively charged residues on the biological activity of amphipathicα－h(huán)elical cationic antimicrobial peptides［J］.Biopolymers，2008，90（3）：369－383.

［18］ Rekdal，Haug B E，Kalaaji M，et al.Relative spatial positions of tryptophan and cationic residues in helical membrane－active peptides determine their cytotoxicity［J］.J Biol Chem，2012，287（1）：233－244.

［19］ Oh D，Shin S Y，Lee S，et al.Role of the hinge region and the tryptophan residue in the synthetic antimicrobial peptides，cecropin A（1－8）－magainin 2（1－12）and its analogues，on their antibiotic activities and structures［J］.Biochemistry，2000，39（39）：11855－11864.

［20］ Strandberg E，Tiltak D，Ehni S，et al.Lipid shape is a key factor for membrane interactions of amphipathic helical peptides［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1818（7）：1764－1776.

［21］ Shai Y.From innate immunity to de－novo designed antimicrobial peptides［J］.Curr Pharm Des，2002，8（9）：715－725.

［22］ 楊細(xì)媚，文陽安，萬祥輝，等.天蠶素A截短肽在大腸埃希菌中的高效表達(dá)及活性分析［J］.中國抗生素雜志，2010，35（1）：20－23.

［23］ Ueta E，Tanida T，Osaki T.A novel bovine lactoferrin peptide，F(xiàn)KCRRWQWRM，suppresses Candida cell growth and activates neutrophils［J］.J Pept Res，2001，57（3）：240－249.

［24］ Shin S Y，Kang J H，Jang S Y，et al.Effects of the hinge region of cecropin A（1－8）－magainin 2（1－12），a synthetic antimicrobial peptide，on liposomes，bacterial and tumor cells［J］.Biochim Biophys Acta，2000，1463（2）：209－218.

［25］ Zasloff M.Antimicrobial peptides of multicellular organisms［J］.Nature，2002，415（6870）：389－395.

［26］ Yount N Y，Yeaman M R.Multidimensional signatures in antimicrobial peptides［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（19）：7363－7368.

Research Progress of Molecular Design of Antimicrobial Peptides

SU Qing－h(huán)ong，XU Xiao－qun，WANG Jun－fu
（Key Laboratory for Modern Medicine and Technology of Shandong Province，Institute of Basic Medicine，Shandong Academy of Medical Sciences，Ji′nan250062，China）

Antimicrobial peptides have shown broad spectrum and efficient antimicrobial activity，and are not easy to induce antibiotic resistance.To obtain higher efficiency and lower toxicity，natural antimicrobial peptides need to be designed and transformed.In this paper，the molecular design of antimicrobial peptides are reviewed，focusing on the related factors affecting their antimicrobial activity and the molecular design methods.

antimicrobial peptide；antimicrobial activity；molecular design

Q 812

A

1672－5425（2012）11－0001－04

10.3969／j.issn.1672－5425.2012.11.001

山東省自然科學(xué)基金資助項目（ZR2010CM067，ZR2009CM036）

2012－08－14

蘇慶紅（1976－），女，山東萊蕪人，碩士，助理研究員，主要從事抗菌藥物的研究，E－mail：qinghong2007ok＠163.com；通訊作者：許曉群，副研究員。