豬瘟和藍(lán)耳病疫苗中BVDV和PCV污染情況調(diào)查

葉兆美

（四川鐵騎力士實(shí)業(yè)有限公司馮光德實(shí)驗(yàn)室，四川 綿陽 621000）

牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）與豬瘟病毒（CSFV）均屬黃病毒科、瘟病毒屬成員。豬瘟細(xì)胞苗在生產(chǎn)過程中要用牛血清、胰酶、牛睪丸等材料，這些材料中若帶有低滴度的BVDV病原，會(huì)造成豬瘟細(xì)胞苗的污染。另外，使用含BVDV抗體的牛血清也會(huì)干擾豬瘟病毒的體外培養(yǎng)。更為嚴(yán)重的是，豬使用污染的豬瘟疫苗后可感染BVDV，出現(xiàn)類似于豬瘟的臨床癥狀和病理變化。王新平等從我國疑似豬瘟病料中檢出了BVDV。BVDV株與CSFV株的核苷酸同源性約60%，氨基酸同源性約85%，在血清學(xué)上存在交叉反應(yīng)，因而血清學(xué)方法難以區(qū)分。近年來，豬瘟細(xì)胞苗質(zhì)量不穩(wěn)定，如滴度偏低，收次減少等，是否與細(xì)胞帶有低滴度的BVDV有關(guān)。豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）是首次作為一種PK15傳代細(xì)胞的污染物被發(fā)現(xiàn)的，血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)PCV1普遍存在于豬體內(nèi)，但是目前還沒有發(fā)現(xiàn)一種疾病與PCV1有關(guān)。PCV2可以導(dǎo)致豬群發(fā)病，PCV2可以在PK15、Vero等細(xì)胞中生長，但是不出現(xiàn)細(xì)胞病變。PCV2感染已成為全球性豬流行病，它對(duì)全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為什么在上世紀(jì)90年代突然暴發(fā)流行，此問題已成為世界豬病的焦點(diǎn)，而PCV2在細(xì)胞中可以生長但又不出現(xiàn)細(xì)胞病變的特點(diǎn)，使得有人懷疑用來培養(yǎng)疫苗病毒的細(xì)胞或種毒本身就受到了PCV2的污染。帶著這些疑問，筆者對(duì)目前市售的豬瘟疫苗和藍(lán)耳病活疫苗進(jìn)行了BVDV和PCV2檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 市售4種豬瘟活疫苗，共計(jì)10個(gè)批次；市售4種豬藍(lán)耳病活疫苗，共計(jì)9個(gè)批次。

1.1.2 牛病毒性腹瀉病毒RT-PCR檢測(cè)試劑盒和豬圓環(huán)病毒聚合酶鏈反應(yīng)PCR檢測(cè)試劑盒，均購自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司；Marker購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 牛病毒性腹瀉病毒PCR檢測(cè)方法 按應(yīng)蓓蓓等（1999）介紹的方法，取凍干豬瘟活疫苗或藍(lán)耳病活疫苗0.02g，加入裂解液，按照說明書提取RNA，進(jìn)行DNA擴(kuò)增，電泳。BVDV目的條帶的擴(kuò)增長度為341bp。

1.2.2 豬圓環(huán)病毒的PCR檢測(cè)方法 按應(yīng)蓓蓓等（1999）介紹的方法，取稀釋備用的豬瘟活疫苗和藍(lán)耳病活疫苗各100μL，加入裂解液，按照說明書提取RNA，進(jìn)行DNA擴(kuò)增，電泳。PCV2目的條帶的擴(kuò)增長度為1154bp，PCV1目的條帶的擴(kuò)增長度為652bp。

2 結(jié)果

2.1 牛病毒性腹瀉病毒的PCR檢測(cè)結(jié)果 用PCR方法檢測(cè)的10份豬瘟活疫苗樣品和9份藍(lán)耳病活疫苗樣品中，有2份樣品為BVDV陽性，BVDV污染率為2/19=10.53%。其中，10份豬瘟疫苗中有1份樣品為BVDV陽性，此樣品為豬瘟脾淋苗；9份藍(lán)耳病疫苗中有1份樣品為BVDV陽性。

2.2 豬圓環(huán)病毒2型的PCR檢測(cè)結(jié)果 用PCR方法檢測(cè)的10份豬瘟活疫苗和9份藍(lán)耳病活疫苗樣品中，PCV2的污染率為2/19=10.53%。其中，10份豬瘟疫苗中有1份樣品為PCV2陽性，與BVDV陽性樣品為同一份樣品；9份藍(lán)耳病疫苗中有1份樣品為PCV2陽性，此樣品為高效細(xì)胞苗。

2.3 豬圓環(huán)病毒1型的PCR檢測(cè)結(jié)果 用PCR方法檢測(cè)的10份豬瘟活疫苗和9份藍(lán)耳病活疫苗樣品中，均未檢出PCV1。

3 討論與分析

3.1 目前，疫苗污染問題較嚴(yán)重，使用無BVDV污染并且無BVDV抗體的牛只供應(yīng)的睪丸細(xì)胞，是生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞疫苗的關(guān)鍵。中國獸藥監(jiān)察所2009年的檢測(cè)報(bào)告顯示，在23批次豬瘟牛睪丸細(xì)胞疫苗中發(fā)現(xiàn)有5批疫苗受牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）污染，污染率為21.74%。長期以來，臨床上所用的豬瘟疫苗主要由豬瘟兔化弱毒株通過牛睪丸細(xì)胞增殖培養(yǎng)而成。2010年據(jù)中國農(nóng)大黃凱等報(bào)道，對(duì)30個(gè)規(guī)模牛場(chǎng)進(jìn)行BVDV抗體抽檢，其陽性率高達(dá)80%以上，表明我國牛群中普遍存在BVDV感染和流行。由于牛病毒性腹瀉病毒與豬瘟病毒同屬黃病毒科瘟病毒屬，同源性很高，因而能互相誘導(dǎo)同源病毒抗體。若將已感染牛病毒性腹瀉病毒或存在相應(yīng)抗體的牛睪丸細(xì)胞用于疫苗制備，會(huì)由于BVDV在體外細(xì)胞培養(yǎng)中大多不產(chǎn)生細(xì)胞病變而在疫苗生產(chǎn)中難以檢測(cè)出來，從而極易造成受污疫苗出廠。在細(xì)胞培養(yǎng)中，所用犢牛血清若含有牛病毒性腹瀉病毒或相應(yīng)抗體，則常規(guī)熱滅活方法仍不能保證完全殺滅犢牛血清中的BVDV，因此同樣容易導(dǎo)致疫苗受污染。

3.2 豬瘟抗體一直很高，為什么還會(huì)暴發(fā)豬瘟？BVDV感染妊娠母豬后可引起母豬繁殖障礙,誘發(fā)母豬流產(chǎn),產(chǎn)死胎和弱仔；還可以通過胎盤將病毒傳給胎兒，使其產(chǎn)下的仔豬發(fā)生先天性感染；BVDV也可引發(fā)2～4周齡的仔豬發(fā)病，臨床上表現(xiàn)為貧血，被毛粗亂，吃料少，消瘦，生長緩慢，結(jié)膜炎、關(guān)節(jié)炎，腹瀉，多數(shù)仔豬發(fā)生死亡，少數(shù)成為僵豬。剖檢可見心外膜、腎臟及淋巴結(jié)有多量出血點(diǎn)，胃、結(jié)腸、盲腸黏膜潰瘍,有多量扣狀腫，與慢性豬瘟在臨床癥狀和病理變化方面十分相似，鑒別與檢測(cè)都非常困難。BVDV感染豬只后，對(duì)豬瘟疫苗的免疫有干擾作用，能抑制豬瘟抗體的產(chǎn)生，致使豬瘟保護(hù)性抗體水平低下，同時(shí)卻產(chǎn)生大量的BVDV抗體，導(dǎo)致豬瘟免疫失敗。由于現(xiàn)在部分廠家的豬瘟抗體檢測(cè)試劑盒不能有效區(qū)分豬瘟抗體和BVDV抗體，所以就會(huì)出現(xiàn)明明檢測(cè)出很高的豬瘟抗體，但豬群仍然會(huì)暴發(fā)豬瘟的情況。而其實(shí)檢測(cè)出的抗體中，真正的豬瘟保護(hù)抗體很少，大部分可能為BVDV抗體。

3.3 北京世紀(jì)元亨公司的牛病毒性腹瀉病毒PCR試劑盒不能區(qū)分是豬源BVDV還是牛源BVDV，所以本試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果也不能分辨陽性樣品是豬源BVDV還是牛源BVDV；本試劑盒也不能對(duì)BVDV1和BVDV2血清型進(jìn)行區(qū)別。

3.4 據(jù)報(bào)道顯示，目前還未發(fā)現(xiàn)PCV1對(duì)豬群有致病性。PCV2感染會(huì)損害患畜的免疫器官，降低機(jī)體免疫力，導(dǎo)致其他疾病的繼發(fā)感染；尤其是公豬感染PCV2后會(huì)通過精液傳播給母豬群，導(dǎo)致豬群迅速感染，這是豬群中潛在的傳播方式。所以使用有PCV2污染的疫苗對(duì)豬群進(jìn)行免疫，將對(duì)豬群造成極其嚴(yán)重的危害。

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[2]王新平，涂長春，李紅衛(wèi)，等.從疑似豬瘟病料中檢出牛病毒性腹瀉病毒[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1996，16（4）：341-345.

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[4]黃凱，張俊杰，劉英霞，等.北京地區(qū)規(guī)?；?chǎng)BVDV持續(xù)感染牛清除方案的初步實(shí)施 [J].中國動(dòng)物檢疫，2010，（5）：34-35.