國內(nèi)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花及相關(guān)抗性基因研究概述

王 霞 ，馬燕斌 ，吳 霞 ，梁愛華 ，馬冬菊 ，王 華 ，李燕娥

（1.運城學院生命科學系，山西運城044000；2.山西省農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所，山西運城044000；3.山西大學生物技術(shù)研究所，山西太原030006）

草甘膦是一種廣譜性滅殺除草劑。由于其具有在土壤中極易降解和對環(huán)境幾乎不造成為害等優(yōu)點，已經(jīng)得到大面積推廣使用[1]。但是在農(nóng)田中使用草甘膦滅殺雜草的同時，往往也會對作物造成損害。

為此，研究培育具有抗或耐草甘膦除草劑的作物新品種成為育種的重點目標。棉花是我國重要的經(jīng)濟作物，其中，國內(nèi)以山西省農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所為代表的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的成功研制，極大地促進了我國棉花的生產(chǎn)發(fā)展，也為以后我國新的轉(zhuǎn)基因棉花選育改良等研究奠定了堅實的基礎(chǔ)[2-4]。

結(jié)合現(xiàn)階段棉花生產(chǎn)的實際發(fā)展需求，筆者對我國在抗草甘膦除草劑棉花的研究應(yīng)用等相關(guān)內(nèi)容進行了概括探討。

1 草甘膦除草劑與棉花的抗草甘膦對策

植物能夠通過莖葉吸收草甘膦，而草甘膦是通過抑制植物體內(nèi)芳香族氨基酸合成途徑中的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS酶）的活性，阻斷芳香族氨基酸的合成，從而殺滅雜草。由于草甘膦對所有植物的該代謝途徑作用效果相同，所以，在草甘膦殺滅雜草時，對所有植物的作用機理相同。因此，除草劑的使用實現(xiàn)了對作物田內(nèi)雜草的免除，同時也可降低勞動力的使用及提高生產(chǎn)效率，但由于作物本身對草甘膦不具有耐藥性，因而，草甘膦的使用也會對作物產(chǎn)生藥害。

針對這一狀況和潛在的商業(yè)利益，各國科研工作者開始進行抗草甘膦育種的研究。我國科研人員也進行了積極的研究來防止其為害發(fā)生，并取得了一定的成果。解決方法除了通過在田間噴灑除草劑進行預(yù)防外，通過常規(guī)育種選育和基因工程等手段來獲得抗除草劑的棉花等作物，也是解決這一問題的有效途徑。具體的方法原理包括幾點。

一是通過不同草甘膦濃度水平脅迫的方法選擇育種。這一手段的目的是在一定濃度的草甘膦抑制前提下，植物體內(nèi)仍有足夠的EPSPS酶進行正常代謝，最終使選育出的作物耐草甘膦性提高。二是通過分子技術(shù)手段。其包括過量表達作物自身的EPSPS酶、對EPSPS酶本身進行突變修飾以及對EPSPS酶的代謝途徑進行修飾，使作物的EPSPS酶降低或不受草甘膦抑制而保持正常的代謝。三是利用某些微生物的EPSPS酶。該方法與第2種方法類似，但由于親緣關(guān)系較遠，蛋白序列差異較大，因此，篩選到不受草甘膦抑制或受抑制作用較小的EPSPS酶的可能性較大。四是尋找能夠分解代謝草甘膦的基因，將這一類基因轉(zhuǎn)入目標植物后在細胞內(nèi)形成一類防護機制，從而保護目標植物不受草甘膦藥害。五是通過物理或化學等手段處理（包括體細胞誘變、輻照和化學誘變劑等）作物后獲得抗性基因突變體植株。這一方法操作簡單，篩選的基因型突變有可能更加廣泛，但能夠獲得抗性植株的概率較小，且基因型突變鑒定的后期工作量較大。

2 抗草甘膦基因來源及相關(guān)分子生物學研究

研究表明，EPSPS酶和GAT基因編碼的草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶能夠?qū)Σ莞熟⒖剐云鸬揭欢ㄗ饔?，其中，對EPSPS酶的研究較多，應(yīng)用也較為廣泛，而草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶及其GAT編碼基因的研究相對較少。目前，通過生物工程手段利用的主要是抗草甘膦EPSPS合成酶，根據(jù)基因序列比對和抗體試驗結(jié)果，該基因可分為EPSPSⅠ和EPSPSⅡ。這2類EPSPS基因的序列同源性僅為50%左右，抗體作用不發(fā)生交叉反應(yīng)，且這2類編碼基因來源廣泛，包括各類植物和微生物。

劉柱等[5]從極端污染的土壤中分離到1株對草甘膦有極端抗性的細菌菌株HTG7。它能夠在以草甘膦為選擇壓力的限制性培養(yǎng)基上生長，其最高耐受能力為500mmol/L。劉光全等[6]通過PCR突變技術(shù)獲得了具有EPSPS酶功能而不具有草甘膦抗性的Pmu1和Pmu2突變株，并通過蛋白結(jié)構(gòu)模擬和測序手段預(yù)測其突變位點對草甘膦抗性的重要性。

除通過對微生物的抗草甘膦特性進行篩選獲得EPSPS基因外，在植物的EPSPS基因研究方面，尉萬聰?shù)萚7]通過草甘膦處理誘導(dǎo)大豆和棉花的表達，克隆了相關(guān)的63個有差異的EST序列。程海剛等[8]對青麻EPSPS基因在酵母中表達認為，該基因具有生物學功能。周曉卉等[9]進行了薤白EPSPS合成酶基因cDNA的克隆與原核表達分析，認為薤白EPSPS對草甘膦具有一定的抗性。鄧運濤等[10]對諸葛菜EPSPS基因5′端的克隆和序列進行了分析。童旭宏等[11]克隆獲得了陸地棉的1個拷貝EPSPS基因，該基因編碼序列長度為1 566 bp，其組織特異性表達具有一定的差異。

3 棉花及其他作物中EPSPS酶的研究

我國在抗草甘膦除草劑的轉(zhuǎn)基因棉花等方面進行了較多研究。祝水金等[12]利用體細胞連續(xù)定向篩選技術(shù)，結(jié)合體細胞誘變技術(shù)獲得了非轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花突變體株。陳旭升等[13]利用草甘膦篩選到1個抗草甘膦棉花種質(zhì)系G-6，通過抗性遺傳規(guī)律分析，認為抗性符合3∶1的分離規(guī)律，抗性受1對顯性基因控制。謝龍旭等[14]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法把抗草甘膦基因aroAM12導(dǎo)入棉花中，并對其抗性進行了研究。劉錫娟等[15]把熒光假單胞菌種克隆的EPSPS基因轉(zhuǎn)入煙草和棉花中獲得抗草甘膦植株。趙福永等[16]成功地將抗草甘膦基因aroA-M1導(dǎo)入棉花中。此外，山西省農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所與浙江大學等國內(nèi)單位合作，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法培育新型的抗草甘膦與抗蟲棉花也已經(jīng)取得巨大進展。

同時，在玉米、水稻、大豆等作物中也有較多的研究報道。王秀君等[17]利用花粉管通道法把mG2-EPSPS基因?qū)胗衩鬃越幌抵?，并獲得能耐受0.25%草甘膦藥液的抗性植株。蘇軍等[18]利用Error-prone PCR獲得的EPSPS酶突變基因轉(zhuǎn)入水稻中，并進行了較詳細的抗性和農(nóng)藝性狀的調(diào)查研究。王曉波等[19]對外源抗草甘膦EPSPS基因在大豆基因組中的整合與定位進行了研究，發(fā)現(xiàn)插入位點中NOS下游的大豆基因組序列發(fā)生重排，導(dǎo)致一個編碼HEC1和HEAT的功能域基因結(jié)構(gòu)受到影響。除此之外，鄧力華等[20]利用EPSPS基因作為選擇性篩選標記構(gòu)建了抗蟲表達載體，為其后續(xù)的轉(zhuǎn)基因作物篩選利用提供了多樣化。另外，卜貴軍等[21]研究了對大豆噴施草甘膦后，草甘膦對大豆葉片超微結(jié)構(gòu)及生化指標的影響。劉延等[22]對草甘膦噴施田旋花和打碗花后體內(nèi)草莽酸含量進行了初步分析。

4 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的生物安全性研究

目前，轉(zhuǎn)基因?qū)ι锇踩缘挠绊懕妒荜P(guān)注，但相關(guān)研究的結(jié)論性結(jié)果較少。其中，徐廣惠等[23]認為，轉(zhuǎn)基因大豆在不同程度上降低了根際土壤細菌的數(shù)量和細菌群落的多樣性，并對根際土壤中Nitrospira屬細菌有一定的抑制作用。但抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆對節(jié)肢動物群落多樣性無明顯影響[24]。而用含轉(zhuǎn)基因豆粕的飼料飼喂大鼠時，在胃、腸道內(nèi)容物中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因豆粕的內(nèi)源基因和外源基因片段，但在其血液及各組織器官中則沒有發(fā)現(xiàn)[25]。另外，自然條件下人為加大蟲媒傳播（大于10頭/m2），抗草甘膦基因的花粉漂移概率接近0.05%，漂移距離為0.7 m[26]。此外，宋小玲等[27]以抗除草劑草甘膦和草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜為父本、諸葛菜為母本，在人工授粉條件下研究抗性基因向諸葛菜的潛在基因漂移，認為抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜的抗性基因向諸葛菜漂移的可能性較小。

目前，關(guān)于植物轉(zhuǎn)基因的安全性評價問題存在諸多爭論。國內(nèi)已有對轉(zhuǎn)基因安全性的研究，但均屬初步探討，試驗結(jié)果仍待探究。而毋庸置疑的是，轉(zhuǎn)基因技術(shù)手段對植物基因功能的研究具有極大幫助。在作物基因利用方面，我國棉花抗蟲性的成功對于棉花生產(chǎn)具有巨大促進作用，但轉(zhuǎn)基因作物安全性仍將面臨諸多爭論與挑戰(zhàn)。

5 抗草甘膦基因?qū)＠c轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化競爭

我國是草甘膦使用較多的國家，在與草甘膦相關(guān)抗性基因的研究方面雖然取得一定的進展，但與國外相比差距仍然較大。宋敏等[28]對抗草甘膦基因EPSPS的專利保護進行分析，結(jié)果表明，EPSPS的專利申請量迅速增加，且絕大部分專利由孟山都等跨國公司擁有；而我國目前申請的EPSPS基因?qū)＠鄬^少。在抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花等作物的商業(yè)化方面，棉花、玉米、大豆、甜菜、馬鈴薯等多種抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物在美國、阿根廷、加拿大、巴西等國被批準種植，中國也已批準棉花、玉米、大豆、油菜的種植，但目前并沒有看到國內(nèi)科研機構(gòu)或公司等在上述作物育種審定方面的報道。另外，相比國外公司或單位所申請的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物種類種植許可可以看出，我國對抗草甘膦基因及其轉(zhuǎn)基因棉花等作物研究起步相對較遲，但近年來研究非常活躍，這與生產(chǎn)實際需要以及潛在的商業(yè)價值密切相關(guān)；無論如何，抗草甘膦或其他轉(zhuǎn)基因作物的研究已經(jīng)成為目前作物遺傳育種中重要的組成部分。

6 結(jié)語

到目前為止，世界上商業(yè)化的抗草甘膦棉花等作物的種植面積和種類在不斷增加?；谵D(zhuǎn)基因作物培育的競爭趨勢，認為當前應(yīng)積極篩選新的有利用價值的抗草甘膦基因，并詳細闡明基因功能以及對其進行知識產(chǎn)權(quán)保護和開發(fā)利用，對我國培育具有競爭優(yōu)勢的棉花等作物品種將會具有明顯的推動作用。目前，我國通過轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項投入，極大地推動了我國在轉(zhuǎn)基因作物領(lǐng)域的競爭發(fā)展，而轉(zhuǎn)基因作物的研究發(fā)展將會更加廣泛。鑒于此種發(fā)展趨勢，科學地改進目前轉(zhuǎn)基因的方法、嚴格界定轉(zhuǎn)基因作物利用目的和種類、積極培養(yǎng)高素質(zhì)科研人員以及規(guī)范轉(zhuǎn)基因法律法規(guī)等對轉(zhuǎn)基因安全性都能夠起到一定的積極作用。此外，棉花生產(chǎn)在滿足我國不同消費需求方面將會發(fā)揮重要作用，而安全利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對促進我國棉花等作物的生產(chǎn)具有重要意義。

[1]蘇少泉.草甘膦述評[J].農(nóng)藥，2005，44（4）：145-149.

[2]范巧蘭，陳耕，李永山，等.轉(zhuǎn)Bt基因棉花不同生育期對土壤微生物的影響[J].山西農(nóng)業(yè)科學，2010，38（12）：34-36.

[3]上官小霞，吳霞，李燕娥.棉花GhRDL1基因啟動子分析[J].華北農(nóng)學報，2010，25（1）：6-10.

[4]張林水，吳霞，杜春芳，等.轉(zhuǎn)基因抗蟲棉晉棉44號選育研究及高產(chǎn)栽培要點[J].山西農(nóng)業(yè)科學，2007，35（6）：49-52.

[5]劉柱，陳明，徐玉泉，等.一株草甘膦極端抗性菌株的分離和分子鑒定[J].高技術(shù)通訊，2002（12）：25-28.

[6]劉光全，劉柱，陸偉，等.草甘膦抗性新基因的克隆、序列分析及其蛋白高級結(jié)構(gòu)預(yù)測 [J].中國生物化學與分子生物學報，2006，22（3）：197-203.

[7]尉萬聰，張銳，郭三堆.草甘膦誘導(dǎo)表達的大豆與棉花EST序列的分離[J].中國生物工程雜志，2005，25（7）：80-85.

[8]程海剛，張銳，羅淑萍，等.青麻epsps基因在酵母中表達[J].新疆農(nóng)業(yè)大學學報，2007，30（4）：52-56.

[9]周曉卉，黃麗華，蔣向，等.薤白EPSP合成酶基因cDNA的克隆與原核表達分析 [J].中國農(nóng)業(yè)科學，2009，42（7）：2297-2304.

[10]鄧運濤，吳俊，茍曉松，等.諸葛菜EPSPS基因5′端的克隆和序列分析[J].四川大學學報：自然科學版，2003，40（3）：570-573.

[11]童旭宏，吳玉香，祝水金.陸地棉EPSPS基因的克隆及其組織特異性表達分析[J].棉花學報，2009，21（4）：259-64.

[12]祝水金，汪靜兒，俞志華，等.棉花抗草甘膦突變體篩選及其在雜種優(yōu)勢利用中的應(yīng)用 [J].棉花學報，2003，15（4）：227-230.

[13]陳旭升，劉新民，狄佳春，等.陸地棉抗草甘膦性狀的遺傳規(guī)律分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2009（1）：76-77.

[14]謝龍旭，李云鋒，徐培林.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)aroAM12基因棉花植株的草甘膦抗性 [J].植物生理與分子生物學學報，2004，30（2）：173-178.

[15]劉錫娟，劉昱輝，王志興，等.轉(zhuǎn)5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）基因抗草甘膦煙草和棉花的獲得[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2007，15（6）：958-963.

[16]趙福永，謝龍旭，田穎川，等.抗草甘膦基因aroAM12及抗蟲基因Bts1m的轉(zhuǎn)基因棉株 [J].作物學報，2005，31（1）：108-113.

[17]王秀君，郎志宏，陸偉，等.利用花粉管通道法將耐草甘膦基因mG2-epsps導(dǎo)入玉米自交系的研究初報[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2008，10（4）：56-62.

[18]蘇軍，陳建民，田大剛，等.Error-prone PCR獲得EPSP酶突變基因提高水稻的草甘膦抗性 [J].分子植物育種，2008，6（5）：830-836.

[19]王曉波，蔣凌雪，魏利，等.外源抗草甘膦EPSPs基因在大豆基因組中的整合與定位 [J].作物學報，2010，36（3）：365-375.

[20]鄧力華，于元杰，李寶健，等.Epsps基因為篩選標記的多基因抗蟲表達載體構(gòu)建[J].生物技術(shù)，2008，18（1）：9-13.

[21]卜貴軍，鄭小江，王學東，等.草甘膦對大豆葉片超微結(jié)構(gòu)及生化指標的影響 [J].中國油料作物學報，2010，32（2）：285-289.

[22]劉延，張朝賢，黃紅娟，等.草甘膦對田旋花和打碗花體內(nèi)莽草酸含量的影響[J].雜草科學，2008（2）：10-11.

[23]徐廣惠，王宏燕，劉佳.抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆（RRS）對根際土壤細菌數(shù)量和多樣性的影響[J].生態(tài)學報，2009，29（8）：4535-4540.

[24]吳奇，彭煥，彭可維，等.抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆對豆田主要害蟲發(fā)生動態(tài)的影響[J].植物保護，2007，33（5）：50-53.

[25]趙志輝，楊立桃，艾曉杰，等.轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆對大鼠生理代謝的影響及外源基因水平轉(zhuǎn)移研究[J].南京農(nóng)業(yè)大學學報，2006，29（1）：77-80.

[26]呂曉波，王宏燕，劉琦，等.抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆（RRS）在黑土生態(tài)系統(tǒng)種植的安全性研究 [J].大豆科學，2009，28（2）：260-265.

[27]宋小玲，強勝.抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜向雜草諸葛菜的潛在基因漂移[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2003，31（4）：526-529.

[28]宋敏，劉麗軍，蘇穎異，等.抗草甘膦EPSPS基因的專利保護分析[J].中國生物工程雜志，2010，30（2）：147-152.