疾病標(biāo)志物——血清microRNA的研究進(jìn)展

戴啟宇，楊廷桐，于芳芳

尋找疾病標(biāo)志物一直是醫(yī)學(xué)界探索研究的重要領(lǐng)域。標(biāo)志物在早期診斷、個(gè)體化治療、預(yù)后判斷等諸多方面都具有重要價(jià)值。新近研究發(fā)現(xiàn)：血液中micro RNA（miRNA）能夠游離于細(xì)胞之外，穩(wěn)定存在于循環(huán)血液中，其在組織或血清中的異常表達(dá)與多種人類疾病密切相關(guān)[1]，并在多種疾病診斷和預(yù)后判斷中顯示了獨(dú)特價(jià)值。血清miRNA檢測(cè)，不僅創(chuàng)傷小、方法簡便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，且還可以改進(jìn)疾病診斷、癌癥分類、預(yù)后評(píng)估、療效及復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)的精度?？梢妋iRNA已具備了疾病標(biāo)志物的特點(diǎn)。目前，檢測(cè)血液中miRNA表達(dá)譜的技術(shù)已經(jīng)成熟，精確度和靈敏度可滿足臨床需求，因此，miRNA有望成為血液中新興的疾病診斷和預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。

1 miRNA的生物學(xué)特征及功能

1.1 生物學(xué)特征 miRNA是一組由動(dòng)物、植物和病毒基因組所編碼的一類分子非編碼單鏈RNA，長約19～25個(gè)核苷酸，它們不具有開放閱讀框（ORF），不編碼蛋白質(zhì)，但卻參與機(jī)體的各種重要的生理和病理過程，它們能夠與靶mRNA的3＇-UTR（untranslated region）區(qū)的堿基互補(bǔ)配對(duì)而起作用，使其翻譯受到抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)生物體內(nèi)基因時(shí)序性表達(dá)起到精細(xì)調(diào)節(jié)作用[2]，對(duì)機(jī)體生長、發(fā)育及各種疾病尤其是腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有重要的調(diào)節(jié)功能[3]。幾乎成為基因表達(dá)強(qiáng)有效的調(diào)控因子，據(jù)推測(cè)人類約有1/3基因編碼的mRNA受到miRNA的負(fù)調(diào)控[4]。研究表明，每個(gè)miRNA可能調(diào)節(jié)數(shù)百個(gè)靶基因，參與生命活動(dòng)中眾多的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、免疫反應(yīng)及血管生成等一系列過程中發(fā)揮作用[5，6]。具有嚴(yán)格的時(shí)空性和組織的特異性。

1.2 生物學(xué)功能 眾所周知，血漿或血清中存在大量的外切酶，已有實(shí)驗(yàn)顯示裸露的mRNA或miRNA在加入血漿或血清中后會(huì)很快降解[7]。因此，miRNA肯定不是以裸露的形式存在于血漿、血清中，一定存在某種保護(hù)機(jī)制來抵抗RNA酶的作用。血漿、血清miRNA的功能研究的前提是應(yīng)該闡明其存在形式、釋放機(jī)制、受體細(xì)胞是如何接受的等問題。已有證據(jù)顯示細(xì)胞在生理或病理狀態(tài)下，能釋放或脫落某些具有膜結(jié)構(gòu)的微泡，直徑從數(shù)十納米至數(shù)微米不等，按照大小或來 源 不 同 取 名 為 exosome、microparticle、microvesicle、apoptoticbody等，這些微泡中就含有miRNA，其膜結(jié)構(gòu)可以抵抗RNA酶對(duì)miRNA的酶切作用，推測(cè)這是miRNA能穩(wěn)定存在于血漿、血清中的主要原因。盡管已有利用微泡中的miRNA作為疾病標(biāo)志物在非小細(xì)胞肺癌 、卵巢癌以及口腔腫瘤中的研究報(bào)道[8]，但微泡之中成分復(fù)雜，除了miRNA之外，還富含蛋白質(zhì)、DNA和RNA，因此沒有很好的對(duì)照，很難將某種由微泡導(dǎo)致的生物學(xué)效應(yīng)完全歸因于其中的某種miRNA。Zerecke等[9]利用miR-126特異性敲除小鼠，研究了微泡中miR-126的功能。他們發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放的微泡中miR-126的含量最高，并且顯著高于來源內(nèi)皮細(xì)胞的含量；這些微泡在被內(nèi)皮細(xì)胞接受的同時(shí)，將miR-126傳遞給受體細(xì)胞，miR-126在受體細(xì)胞內(nèi)含量的增加，通過抑制CXCL12上游的負(fù)調(diào)控因子RGS16，致CXCL12表達(dá)量上調(diào)：利用ApoE（-/-）小鼠在高脂餐誘發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型中研究發(fā)現(xiàn)，CXCL12表達(dá)量增高后，可以促進(jìn)lin-Sca-1+內(nèi)皮祖細(xì)胞在粥樣斑塊形成之初就聚集在斑塊周圍，進(jìn)行損傷修復(fù)，從而減少斑塊面積，防止斑塊形成，維持斑塊穩(wěn)定。這項(xiàng)研究，首次正面回答了血漿、血清miRNA是否具有生物學(xué)活性的問題，并且提供了血漿、血清miRNA研究可供借鑒的思路。

2 miRNA檢測(cè)的方法學(xué)研究

目前國內(nèi)外采用血中miRNA檢測(cè)方法主要有：miRNA芯片、高通量測(cè)序法（Illina／Solexa）、Northern blot法和熒光實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（QRT-PCR）法等[10]。提取需要的血液樣本量，從100 μl到2 ml不等，Chen等[11]的研究就采用Solexa測(cè)序方法，并且可以發(fā)現(xiàn)和鑒定新的miRNA分子，但是價(jià)格偏高。相比之下miRNA芯片（microarray）要比測(cè)序方法價(jià)格便宜許多，缺點(diǎn)是重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性比較差，只用于疾病相關(guān)循環(huán)miRNA的初篩，這種方法只能對(duì)已知的miRNA進(jìn)行檢測(cè)，無法尋找和發(fā)現(xiàn)新的miRNA分子。Northern blot方法繁瑣且靈敏度低，不宜用于高容量檢測(cè)。那么miRNA血中表達(dá)與量檢測(cè)的最好方法是QRT-PCR法，此法操作簡便、快速、高效、敏感性高和特異性強(qiáng)。Chen等使用10 μl血清進(jìn)行不提取RNA，直接QRT-PCR分析的結(jié)果，與血清提取RNA后進(jìn)行QRT-PCR分析的結(jié)果一致。如能優(yōu)化這種方法將顯著減少血清用量、步驟及成本。采用Taqman探針或者SYBR熒光染料檢測(cè)的QRT-PCR法主要是基于莖-環(huán)的RT-PCR方法（stem-loop RT-PCR）和基于poly（A）加尾的TR-PCR方法。前者特異性更高，后者通用性好。

3 miRNA在臨床醫(yī)學(xué)中的研究

從2008年血漿、血清中存在miRNA最早被報(bào)道后，對(duì)它的研究一直方興未艾，至今所涉及的疾病領(lǐng)域主要為腫瘤和非腫瘤兩大類。

3.1 腫瘤類疾病 miRNA在不同條件下可行使癌基因或抑癌基因的功能，有些miRNA表達(dá)具有組織特異性，如miR-122僅在肝臟中表達(dá)，有些miRNA在腫瘤中表達(dá)上調(diào)，如：miR-21在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、胃癌等[12]。有些miRNA在腫瘤中表達(dá)下調(diào)，如：miR-15a和miR-16在垂體腺瘤和慢性B型淋巴細(xì)胞性白血病等[13]。let7家族在肺癌中下調(diào)，預(yù)示肺癌的發(fā)生及術(shù)后生存期短，此外，MYC蛋白的過表達(dá)也可以直接抑制let7家族的活性[14]。miR-122的調(diào)控功能涉及肝臟細(xì)胞生長、代謝、蛋白表達(dá)和病毒感染等多種過程，miR-122下調(diào)表達(dá)和肝癌發(fā)病密切相關(guān)。miR-25、miR-34家族調(diào)節(jié)p53的表達(dá)，在多種腫瘤中起重要的調(diào)控作用[15，16]，而且miR-34b/miR-34c在胃癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤等腫瘤中均表達(dá)下調(diào)。此外，miR-145的表達(dá)下調(diào)與乳腺癌和結(jié)腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。在腫瘤組織下調(diào)表達(dá)的miRNA靶基因大部分增強(qiáng)了細(xì)胞的生長、發(fā)育或增值活性，當(dāng)miRNA表達(dá)下調(diào)時(shí)，這些基因過量表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞生長失去控制，發(fā)生癌變。

血清中是否存在miRNA相對(duì)應(yīng)的表達(dá)譜，一直是研究者所關(guān)注的問題，2008年至今已有多項(xiàng)血清miRNA與腫瘤關(guān)系的研究報(bào)道，這就為血清miRNA作為分子標(biāo)記應(yīng)用于臨床腫瘤的早期診斷和預(yù)后提供了工作基礎(chǔ)。血中的miRNA主要來自組織細(xì)胞的主動(dòng)分泌過程[17]，成熟的miRNA在細(xì)胞內(nèi)被脂質(zhì)或脂蛋白包被成外切酶體（Exosome），分泌至胞外并進(jìn)入血液去掉包被，釋放出miRNA發(fā)揮其生物學(xué)功能[18]。外切酶體介導(dǎo)的細(xì)胞間miRNA交換，是細(xì)胞通訊的一種新的途徑，對(duì)維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)有重要作用[19]。

3.1.1 消化道腫瘤 2010-02血漿中的miR-92被成功用作診斷結(jié)直腸癌的分子標(biāo)志物，靈敏度可達(dá)89%，特異性達(dá)到70%，術(shù)后顯著降低；更加令人興奮的是，通過miR-92作為分子標(biāo)志物可以診斷Ⅰ～Ⅳ期的結(jié)直腸癌，而早期診斷可以大大提高生存率和改變預(yù)后[20]。Huang等[21]研究發(fā)現(xiàn)miR-29a和-92a在CRC患者血漿中明顯增高。Wang等[22]研究了胰腺導(dǎo)管腺癌（pancteaticductal adeenocarcinoma，PDA）患者血漿中miRNA的水平，發(fā)現(xiàn)miR-155的水平在腫瘤形成的早期就明顯增高，而miR-196a的水平高低和患者病程相關(guān)，其靈敏度和特異度分別是64%和89%。Tsujiura等[23]對(duì)胃癌患者血漿中miR-21、-106a、-106b、-17-5p和let-7a的水平與健康人進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)在胃癌患者血漿中l(wèi)et-7a明顯降低，而其余4個(gè)miRNA均顯著增高。

3.1.2 肺癌 Chen等[24]挑選了利用測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)的在肺癌患者中具備有效拷貝數(shù)的miR-25和-223兩種miRNA顯著上調(diào)。Hu等[25]為研究血清miRNA在肺癌患者預(yù)后判斷中的作用，挑選了60例Ⅰ～Ⅲa期的肺癌患者，這些患者均接受手術(shù)和化療，按照生存期的長短分為較長和較短生存期2個(gè)亞組各30例，所有患者的血清均采用高通量測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)至少11個(gè)miRNA的變化在5倍以上，在隨后243例肺癌患者血漿標(biāo)本的驗(yàn)證過程中，發(fā)現(xiàn)其中miRNA-486、-30d、-1和-499可以作為總生存率獨(dú)立的預(yù)測(cè)因子，亦可作為肺癌檢測(cè)的標(biāo)志物。miRNA幾乎參與了肺癌病變進(jìn)程的每一個(gè)環(huán)節(jié)，對(duì)基因的調(diào)控改變了腫瘤表達(dá)狀態(tài)[26，27]。

3.1.3 血液系統(tǒng)腫瘤 ①彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤：關(guān)于血清中miRNA是否可運(yùn)用于腫瘤診斷研究，最早的報(bào)道來自Lawrie等[28]在大 B細(xì)胞淋巴瘤 （diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）的研究，他們挑選了和腫瘤相關(guān)miR-155、-210、-21，比較了在DLBCL患者和健康人群之間血清水平的差異，發(fā)現(xiàn)DLBCL患者血清中三者的含量均顯著高于健康人，且血清miR-21的不同水平?jīng)Q定了患者不同的生存曲線；與此前miR-21與預(yù)后良好正相關(guān)的報(bào)道吻合；②急性白血?。篢anaka等[29]利用miRNA芯片比較了急性白血?。╝cute leukemia，AL）患者和健康人之間的血漿miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)運(yùn)用miR-92a和-638的比值能顯著的區(qū)分AL患者和健康人；進(jìn)一步運(yùn)用原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)，無論是急性髓細(xì)胞白血病和急性淋巴細(xì)胞性白血病患者，其腫瘤細(xì)胞中miR-92a的含量均明顯增高，而在健康人中含量微弱。

3.1.4 乳腺癌 在對(duì)乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)：血清miR-155水平在乳腺癌和非乳腺癌患者中沒有顯著性差異，但miR-155在孕酮受體陽性的乳腺癌患者血清的表達(dá)水平高于孕酮受體陰性的患者[30]，提示miR-155可以作為區(qū)分激素敏感性和非敏感性的乳腺癌患者的分子標(biāo)志物，進(jìn)一步證明血清miRNA具有成為腫瘤診斷和預(yù)后標(biāo)志物的潛力。Heneghan等[31]挑選了和乳腺癌相關(guān)的7個(gè)miRNA在乳腺癌患者的腫瘤組織和血漿中進(jìn)行了比對(duì)，發(fā)現(xiàn)miR-195是乳腺癌組織特異的miRNA，在血漿中的水平均要高于正常，能很好地反映患者腫瘤生長的臨床病理特征，并與淋巴轉(zhuǎn)移以及孕酮受體的狀態(tài)等均密切相關(guān)。miR-21的改變與腫瘤耐藥有密切關(guān)系[32]。

3.1.5 口腔腫瘤 在對(duì)舌鱗狀上皮細(xì)胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-184在癌組織中的表達(dá)提高了59倍以上，患者術(shù)后的血漿miR-184表達(dá)量降低到只有原來的1/10，這表明血清中miRNA表達(dá)譜的變化與腫瘤組織關(guān)系密切，血清miRNA表達(dá)譜有可能替代組織miRNA表達(dá)譜作為口腔腫瘤標(biāo)志物[33]。正常人血清含量很低或無法檢測(cè)到，而在腫瘤患者血清中含量較高的miRNA可以確認(rèn)為腫瘤的分子標(biāo)志物。上述研究結(jié)果顯示，血清miRNA與腫瘤組織中miRNA的表達(dá)譜相關(guān)，在以后進(jìn)一步的研究中將加速血清miRNA作為腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用于臨床檢測(cè)的進(jìn)程。

3.2 非腫瘤類疾病 非腫瘤類疾病主要包括妊娠、組織損傷、敗血癥、心衰等研究領(lǐng)域。

3.2.1 妊娠 在對(duì)孕婦血研究中進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)miR-141在早、中、晚期妊娠階段的含量各不相同，在妊娠晚期含量最高[34]。Gilad等[35]也發(fā)現(xiàn)孕婦血漿中miR-526a、miR-527、miR-520d-5p的含量比正常人高出數(shù)百倍，分娩后即下降，因此建議以這3條miRNA的含量來判斷孕婦是否妊娠，并可用于異位妊娠的診斷。

3.2.2 組織器官損傷

3.2.2.1 急性組織損傷 Laterza等[36]為了闡明血漿中組織特異來源的miRNA能作為組織損傷特異標(biāo)志物的概念，制備了3種組織特異損傷的動(dòng)物模型，分別對(duì)骨骼肌特異的miR-133a、肝組織特異的miR-122，以及腦組織特異的miR-124含量進(jìn)行血液檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-133a和miR-122分別在骨骼肌和肝組織損傷后明顯增高，升高倍數(shù)達(dá)到數(shù)百倍至數(shù)千倍，而此時(shí)傳統(tǒng)的骨骼肌損傷和肝損傷標(biāo)志物肌酸激酶（creatine kinase，CK）、 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶 （alanineaminotransferase，ALT）、 天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 （asparate eaminotransferase，AST）輕度增高或增高數(shù)十倍，結(jié)合病理染色，發(fā)現(xiàn)miR-122診斷肝損傷的敏感性要優(yōu)于ALT。同時(shí)，在大惱中動(dòng)脈閉塞后8 h的大鼠血漿中能明確檢測(cè)到腦組織特異的miR-124的增高，24 h增高的更加明顯。這些研究結(jié)果不僅表明骨骼肌、肝組織、腦組織特異的miRNA能作為骨骼肌損傷、肝組織、腦組織損傷特異標(biāo)志物，并且可拓展至所有組織特異的miRNA都能作為該組織損傷特異標(biāo)志物的科學(xué)概念。

3.2.2.2 肝損傷 Wang等[37]比對(duì)惱、心、肝、脾、腎、肺6個(gè)組織和血漿miRNA的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)血漿中miRNA的來源非常廣泛，然后利用過量對(duì)乙酰氨基酚（acetaminophen）灌胃制備藥物性肝損傷小鼠模型，在造模24 h的時(shí)候，對(duì)損傷前后肝組織、血漿中miRNA的表達(dá)譜進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)共有20個(gè)miRNA在肝組織和血漿中均存在明顯變化，其中17個(gè)具有相反的改變趨勢(shì)，其中miR-122、-192在造膜后血漿中明顯增高而肝組織中顯著降低；隨后針對(duì)miR-22、-101b、-122、-133a、-135*、-192、-193和-486進(jìn)行了時(shí)間和計(jì)量的深入研究，發(fā)現(xiàn)這些miRNA在血漿中的含量和對(duì)乙酰氨基酚灌胃呈現(xiàn)很好的時(shí)間、劑量依賴性；不僅如此，肝臟特異的miR-122和-192能在150 mg/kg對(duì)乙酰氨基酚灌胃1 h的時(shí)候就能在血漿中檢測(cè)到顯著的升高，而血漿中ALT的含量尚未有明顯的改變，說明血漿miRNA反映肝臟損傷的靈敏度要優(yōu)于ALT。新近研究發(fā)現(xiàn)肝炎、肝硬化患者血中miRNA-192、-122含量較正常人明顯升高[38]，用實(shí)時(shí)熒光定量Ri-PcR檢測(cè)慢性乙肝及肝病患者血清中miR-21、miR-122、miR-223，顯示比健康人顯著升高，且乙肝患者比肝病患者升高更顯著，因此，推測(cè)這些miR可作為乙肝患者肝損傷的分子標(biāo)志物[38]。

3.2.2.3 急性心肌損傷 JI等[39]為研究心臟組織特異miRNA能否作為心肌損傷的標(biāo)志物，首先比對(duì)了心、腎、肝、骨骼肌miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-208和-490在心臟特異高表達(dá)，在隨后多種組織的定量PCR驗(yàn)證過程中，發(fā)現(xiàn)miR-208是嚴(yán)格意義心臟特異表達(dá)的miRNA，并以此為備選標(biāo)志物；然后利用異丙腎上腺素（320 mg/kg）皮下注射的方法制備了急性心肌損傷大鼠模型，在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行了血漿miR-208定量檢測(cè)，繪制了含量--時(shí)間變化曲線，同時(shí)與肌鈣蛋白比較發(fā)現(xiàn)miR-208在造模3 h即能在血漿中檢測(cè)到顯著性增高，這種增高一直持續(xù)至12 h，在24 h后血漿miR-208的含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；同時(shí)在急性腎梗塞、心肌肥厚的動(dòng)物模型中沒有發(fā)現(xiàn)血漿 miR-208的增高，提示心臟特異miRNA不僅可能是新穎的心肌損傷監(jiān)測(cè)標(biāo)志物，同時(shí)還提示了在某些肌鈣蛋白升高的非心梗疾患中的應(yīng)用前景。AI等[40]則針對(duì)心肌組織高表達(dá)，同時(shí)在心肌缺血后會(huì)表達(dá)增高的miR-1，對(duì)急性心梗人群和非心梗人群血漿中的含量進(jìn)行了研究，他們發(fā)出miR-1在急性心梗人群中的含量要高于非心梗人群，其含量和心電圖QRS波的寬度存在正相關(guān)性，提示血漿中心臟高表達(dá)的miRNA可作為急性心梗診斷新的標(biāo)志物，可能對(duì)急性心梗的預(yù)后判斷具有一定的價(jià)值。

Wang等[41]從理想的心肌標(biāo)志物的特征出發(fā)，篩選了心臟特異高表達(dá)而血漿中缺乏或含量微弱的miRNA作為候選標(biāo)志物，包括miR-208a、-499、-133a和-1，利用開胸結(jié)扎前降支的方法制備了急性心梗動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)這4個(gè)miRNA在冠脈結(jié)扎1 h后均能檢測(cè)到明顯的增加，在6～12 h血漿中含量達(dá)到高峰，24 h的時(shí)候顯著下降，結(jié)合miRNA的表達(dá)譜以及單純開胸不結(jié)扎冠脈的假手術(shù)組血漿中miR-133a、-1和-499也出現(xiàn)不同程度增加的現(xiàn)象，他們認(rèn)為心臟特異的miR-208a是一個(gè)較好候選標(biāo)志物。隨后在小樣本的人群中，研究發(fā)現(xiàn)血漿中這4個(gè)miRNA的平均水平在急性心梗人群中顯著高于非心梗人群，這種差異能有效地區(qū)分心梗人群（ROC分析曲線下面積均在0.8以上）；尤其是miR-208a，在非心梗人群中檢測(cè)不到 （PCR結(jié)果CT值>40），而在90.9%（30/33）的心梗人群中能檢測(cè)到顯著增高。進(jìn)一步對(duì)急性心梗人群按照胸痛時(shí)間進(jìn)行亞組分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，在胸痛4 h以內(nèi)miR-208a對(duì)急性心梗的檢出率要高于肌鈣蛋白，提示血漿miRNA很可能作為急性心梗新的診斷標(biāo)志物。

3.2.3 心力衰竭 通過定量PCR檢測(cè)心衰（HF）患者的血漿miRNA表達(dá)譜并和健康志愿者相比對(duì)，發(fā)現(xiàn)僅有miR-423-5p和-18b*能在胸悶患者中區(qū)分HF和非HF，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-423-5p和血清中腦鈉肽 （brain natriuriceptide，BNP） 存在正相關(guān) （R=0.43，P=0.002）， 和左心室射血分?jǐn)?shù)（EF%）存在負(fù)相關(guān)（R=0.34，P=0.023），提示血漿miR-423-5p是一種有潛力的心衰分子標(biāo)志物[42]。

3.2.4 敗血癥 Vasilescu等[43]首先對(duì)比了敗血癥患者白細(xì)胞miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在所有敗血癥患者中均出現(xiàn)變化的miRNA有4個(gè)，miR-150和-342-5p均下調(diào)，miR-182和-486均上調(diào)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)血漿miR-150的含量和患者序貫性器官衰竭評(píng)分 （SOFA）分值呈負(fù)相關(guān)，其中促炎因子TNFa和抗炎因子IL-10-IL-18在敗血癥患者的血漿中均顯著上升，其含量和miR-150的血漿含量呈負(fù)相關(guān)，利用血漿IL-18和miR-150的比值，進(jìn)一步可以區(qū)分miR-150含量不同的敗血癥患者。Wang等[44]經(jīng)過綜合研究發(fā)現(xiàn)，血液中miR-146a和-223含量能有效的區(qū)分感染和非感染原因?qū)е碌臄⊙Y和系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）患者，當(dāng)特異度為100%時(shí)，其靈敏度分別是63.3%和80%。

4 microRNA作為腫瘤標(biāo)志物的應(yīng)用

4.1 優(yōu)勢(shì) 檢測(cè)時(shí)損傷小、穩(wěn)定性好、靈敏度高、可用于早期腫瘤的檢測(cè)。

4.2 缺點(diǎn) 血清中miRNA的含量較低，一般方法學(xué)不易檢測(cè)。

4.3 方法學(xué) 尋找一種靈敏度高、操作簡單且成本低廉的檢測(cè)方法，這是血清miRNA應(yīng)用于腫瘤臨床檢測(cè)急待解決的問題。

4.4 選擇合適的內(nèi)參 內(nèi)參的穩(wěn)定性，決定了檢測(cè)結(jié)果的可靠性，以消除樣品間RNA含量的差異。目前可供選擇的內(nèi)參如：RNU6B,miR-16，miR-24，miR-142-3P，人工合成的外源miRNA及總 RNA等。若同時(shí)檢測(cè)幾種 miRNA，用geNORM，NormFinder，Bestkeeper和REST等軟件進(jìn)行分析，選擇一種或多種變異度較小的miRNA作為內(nèi)參[45]。

4.5 檢測(cè)技術(shù) 電化學(xué)傳感器檢測(cè)技術(shù)的使用，該方法檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.1 pmol，足以滿足檢測(cè)血清miRNA的條件[46]。且實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)也是一種優(yōu)越方法。

4.6 選用上調(diào)標(biāo)志物 優(yōu)先選擇在腫瘤中表達(dá)上調(diào)的血清miRNA，這樣可提高檢測(cè)的靈敏性和特異性[47]。

4.7 多種標(biāo)志物聯(lián)合使用 僅僅采用一種血清miRNA作為腫瘤標(biāo)志物往往特異性不足，若將多種miRNA組合使用并與其它類型腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)相結(jié)合，可望顯著提高診斷的準(zhǔn)確性。

4.8 變異性 個(gè)體間血清miRNA變異較大，探尋腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同時(shí)期個(gè)體血清miRNA表達(dá)譜的變化規(guī)律并闡明作用機(jī)理，是將miRNA檢測(cè)應(yīng)用于惡性腫瘤個(gè)體化診斷的一個(gè)關(guān)鍵問題。

總而言之，很早以前人們致力于血清中疾病標(biāo)志物的研究，但多因不夠穩(wěn)定和特異性差而臨床應(yīng)用前景并不樂觀。然而miRNA最新的研究結(jié)果卻令人驚喜，miRNA具有很強(qiáng)的細(xì)胞、組織或疾病特異性，這些特異性表達(dá)既是其功能研究的基礎(chǔ)，又是很好的疾病標(biāo)志物。Chen[48]利用更加靈敏、特異的高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)血清中所有 18～30 nt的小片段RNA進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在男性和女性血清中分別有100種和91種miRNA。在不同的環(huán)境條件下miRNA在血中仍保持相對(duì)穩(wěn)定，顯示了作為理想的疾病標(biāo)志物所需的某些特征，開創(chuàng)了血中miRNA研究的先河。不僅如此，在血液之外的其他體液，如：唾液、痰中以miRNA作為肺癌、口腔腫瘤標(biāo)志物的研究也顯示了很好的價(jià)值。血液中miRNA作為新興的腫瘤分子標(biāo)志物在未來的腫瘤臨床診斷和治療中將會(huì)顯示更好的應(yīng)用前景[49]。相信隨著研究的深入和拓展，將會(huì)發(fā)現(xiàn)越來越多的血清miRNA作為疾病診斷和預(yù)后的標(biāo)志物，同時(shí)血清miRNA的功能研究，必將成為標(biāo)志物研究之后的又一大熱點(diǎn)。

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