MiR-200a在上皮性卵巢癌中的表達及臨床意義

徐韶華,程文俊,許培箴

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市婦幼保健院婦瘤科,江蘇常州,213003;2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科,江蘇南京,210029)

卵巢癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一,死亡率居女性惡性腫瘤之首,5年生存率不超過40%,70%的卵巢癌發(fā)現(xiàn)已屬晚期[1]。因此,探索卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機制及尋找早期診斷的指標(biāo)一直是卵巢腫瘤研究的熱點。越來越多的研究表明,miRNA在許多惡性腫瘤中存在異常表達,其通過調(diào)控靶基因而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移,發(fā)揮類似癌基因或抑癌基因的作用[2]。miRNA在卵巢癌中的異常表達也被越來越多的研究證實,主要集中在miRNA-200家族中。但是miR-200a在卵巢上皮癌中的表達,不同研究組的結(jié)果并不一致。為此,本研究采用Taqman探針實時熒光定量PCR方法檢測上皮性卵巢癌組織中miR-200a的表達,分析miR-200a與臨床病理特征之間的關(guān)系,探討miR-200a在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 研究對象

組織標(biāo)本來自2008年1月～2011年1月在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科和南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市婦幼保健院婦瘤科行手術(shù)治療的上皮性卵巢癌患者40例,術(shù)前均未接受放療、化療,術(shù)后均經(jīng)病理確診?；颊吣挲g28～72歲,平均53歲。按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)的分期標(biāo)準(zhǔn),Ⅰ期6例、Ⅱ期 10例、Ⅲ期 22例、Ⅳ期2例。病理分級:G1 10例、G2 13例、G3 17例。另取同期年齡匹配的良性上皮性卵巢腫瘤組織30例做對照。所有標(biāo)本離體后10min內(nèi)置于液氮內(nèi)保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取:采用T RIzol法提取組織總RNA,方法按照說明書進行。RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度法進行質(zhì)量控制并進行濃度測定。D260/D280比值在1.7-2.0者用于后續(xù)實驗檢測。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄:用Taqman miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和miRNA特異性莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stem-loop)反轉(zhuǎn)錄引物進行miRNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),操作參照ABI公司實驗流程進行,進行部分調(diào)整?？偡磻?yīng)體系為 15 μ L 。 包括 3 μ L 5 ×反 轉(zhuǎn)錄引物 、0.15 μ L 100 mmol/L dNTP和dT TP混合物、1 μ L反轉(zhuǎn)錄酶(50 U/μ L)、1.5 μ L 10 ×反轉(zhuǎn)錄緩沖液 、0.19 μ L RNA 抑制劑,共5.84 μ L。將上述體系輕柔混勻,輕微離心。每個反應(yīng)體系中加入 9.16 μ L RNA,吹打混勻,輕微離心。將混合好的體系在下列條件下進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):16℃孵育2 min,42℃反應(yīng)1 min,50℃反應(yīng)1 s,上述3步經(jīng)40個循環(huán)反應(yīng),再85℃孵育5 min。

1.2.3 實時定量RT-PCR檢測miR-200a的表達:miRNA每個反應(yīng)體系為5 μ L,其中包括1 μ L稀釋后的 cDNA、0.25 μ L 20×miRNA 檢測探針 、2.5 μ L 2 ×基因表達 Master Mix、1.25 μ L 雙蒸水。每個miRNA檢測配置3平行所需的體系,輕柔混勻,使用ABI Prism7900熒光定量PCR儀,PCR的反應(yīng)條件:95℃5 min※95℃15 s,60℃1 min進行45個循環(huán)。原始數(shù)據(jù)用SDS 2.3軟件進行初步分析。

以U6作為相對定量的內(nèi)參,2-△CT為目的基因的相對表達量[△CT=CTmiR-200a-CT U6]。所有樣本均重復(fù)3孔。

2 結(jié) 果

2.1 上皮性卵巢癌、良性上皮性卵巢腫瘤組織中miR-200a的相對表達量

miR-200a在上皮性卵巢癌組織中的相對表達量為0.0355(0.0043,0.3700),在良性上皮性卵巢腫瘤中的相對表達量為0.0017(0.0004,0.0047)。采用非參數(shù)秩和檢驗,兩者之間差異具有顯著性(P<0.01)。

2.2 miR-200a的相對表達量與上皮性卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系

miR-200a在早期卵巢癌組織(FIGOⅠ+Ⅱ)中的表達量0.1517(0.0047,0.6436)明顯高于晚期卵巢癌組織(FIGO Ⅲ+Ⅳ)中表達量0.0207(0.0031,0.0939),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);在低分化卵巢癌組織中表達量為0.0386(0.0038,0.1257),明顯低于高中分化卵巢癌組織中表達量0.1325(0.0045,0.5892),但差異不具顯著性(P=0.1377);不同腫瘤類型、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌組織中表達量的比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討 論

MicroRNA是一類大小為20-25核苷酸的非編碼小RNA,其通過與靶mRNA 3′UTR區(qū)相結(jié)合導(dǎo)致靶基因的降解或翻譯受抑制,從而調(diào)控基因的表達。最近研究表明,miRNAs與人類多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),已知50%的miRNAs基因位于腫瘤相關(guān)的基因組區(qū)域或者位于脆性位點,促進了腫瘤的發(fā)生和進展,其作用類似于癌基因或抑癌基因[3]。

miR-200a屬于miRNA-200家族,其編碼基因定位于染色體1p35.33。通過其5′末端種子序列AACACU與靶基因mRNA的3′端非編碼區(qū)(3′UTR)部分堿基完全或不完全互補配對,負性調(diào)控基因表達。miR-200a在許多惡性腫瘤如胃癌[4]、肝癌[5]、甲狀腺癌[6]、鼻咽癌[7]、腎透明細胞癌[8]中呈低表達,但在卵巢癌中的表達仍存在爭議。Iorio等[9]通過微列陣芯片研究發(fā)現(xiàn)miRNA-200家族中的 miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141在卵巢上皮癌中均顯著升高。Nam等[10]研究結(jié)果顯示miRNA-200家族在卵巢癌中高表達且和卵巢漿液性腺癌的不良預(yù)后相關(guān)。Dahiya等[11]篩查了34例上皮性卵巢癌和10個卵巢癌細胞系,發(fā)現(xiàn)miR-21,miR-200a,miR-141,let-7表達下降。Hu等[12]發(fā)現(xiàn)miR-200a的低表達與晚期卵巢癌的術(shù)后復(fù)發(fā)及低生存率相關(guān),并可作為判斷卵巢癌預(yù)后差的指標(biāo)。綜合以上各家研究結(jié)果,miR-200a在卵巢癌中表達并不一致,分析存在差異的原因,可能和檢測采用的方法,芯片,樣本量不同有關(guān)。

本研究采用Taqman探針實時熒光定量PCR法檢測發(fā)現(xiàn)miR-200a在上皮性卵巢癌中表達量顯著高于良性上皮性卵巢腫瘤組織(P<0.01),與Iorio和Nam等研究結(jié)果一致,說明miR-200a的高表達是上皮性卵巢癌的重要特征。晚期卵巢癌中表達水平低于早期卵巢癌(P<0.05),但總體表達水平仍高于良性卵巢上皮組織,在低分化組織中表達有明顯下降趨勢,說明在晚期卵巢癌中miRNA-200a的表達下調(diào)可能參與了卵巢癌的惡性進展和轉(zhuǎn)移。

許多研究表明腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟在于發(fā)生了上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化EMT(epithelial-to-mesenchymal transition),這種過程是指已分化的上皮細胞極性喪失獲得了間質(zhì)細胞的表型,降低了細胞間的黏附而易脫落發(fā)生移,腫瘤細胞經(jīng)過EMT過程就獲得了低分化、易侵襲和遠處轉(zhuǎn)移的特征[13]。E-cadherin是維持細胞間穩(wěn)定的關(guān)鍵分子,其表達的丟失是發(fā)生EMT的重要標(biāo)志,一些轉(zhuǎn)錄因子如ZEB1、ZEB2、Snail,可下調(diào)E-cadherin及上調(diào)間質(zhì)來源的波形蛋白表達,從而引起EMT[14]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA-200家族的靶基因之一是鋅指樣轉(zhuǎn)錄因子ZEB1和ZEB2,miR-200a通過 5′端種子序列(AACACU)與ZEB1/ZEB2 mRNA的 3′UTR互補結(jié)合,轉(zhuǎn)錄后抑制ZEB1/ZEB2基因的表達,從而負性調(diào)控E-cadherin的表達[15]。SM Park等發(fā)現(xiàn)miR-200a及其家族在表達E-cadherin的NCI60腫瘤細胞系中高表達,而在間質(zhì)腫瘤細胞系中低表達或缺失,上調(diào)miRNA-200家族的表達能引起E-cadherin表達增高并抑制腫瘤細胞的遷移,相反,抑制miRNA-200家族的表達能明顯降低E-cadherin的表達并誘導(dǎo)EMT,促進腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。Gregory等發(fā)現(xiàn),microRNA-200家族在經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)的乳腺腫瘤細胞發(fā)生EMT過程中下調(diào),伴隨著E-cadherin mRNA水平的降低以及ZEB1/2水平的大幅升高[17]。E-cadherin在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中呈現(xiàn)復(fù)雜的時相性,在正常卵巢上皮表達極少,在早期卵巢癌中E-cadherin表達增加,一旦卵巢癌發(fā)生轉(zhuǎn)移,E-cadherin表達顯著減少[18-19]。

與上述研究結(jié)果一致,本研究發(fā)現(xiàn)miR-200a的表達在早期卵巢癌中先升高,而在晚期卵巢癌顯著下降,亦呈現(xiàn)先高后低的時相性。其可能的機制是早期卵巢癌中miR-200a升高通過抑制其靶基因ZEB1/ZEB2的表達,上調(diào)E-cadherin的表達,在卵巢癌早期E-cadherin高表達可促進卵巢上皮細胞向惡性轉(zhuǎn)化。晚期卵巢癌中miR-200a明顯下降,其靶基因ZEB1/ZEB2的表達上調(diào)導(dǎo)致E-cadherin低表達,使腫瘤細胞低分化程度增加,促進EMT發(fā)生,腫瘤細胞間黏附功能喪失,從原發(fā)灶脫落,發(fā)生播散和轉(zhuǎn)移。另外有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-200家族和ZEB1/2之間存在一個雙重負反饋環(huán)機制,miRNA-200家族通過轉(zhuǎn)錄后抑制ZEB1/2的表達,相反ZEB1/2也可通過抑制miRNA-200家族的轉(zhuǎn)錄來下調(diào)其表達,因而在腫瘤的發(fā)展中起重要作用[20]。

綜上所述,miR-200a在早期卵巢癌中高表達,而在晚期卵巢癌中低表達,提示 miRNA-200a可能作為原癌基因誘導(dǎo)了卵巢癌的發(fā)生,并參與卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移。其可作為卵巢癌早期診斷和判斷預(yù)后的重要分子標(biāo)志。但miR-200a在卵巢癌中表達失調(diào)的機制目前尚不明確,需進一步實驗探討其相關(guān)分子機制。

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