X型膠原在膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨中的表達(dá)

龐金輝,劉明軒,石文俊,樊海峰,陳賢奇,唐桐生,曹成福

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院骨科,上海,200062)

膝骨關(guān)節(jié)炎(OA)因其發(fā)病機(jī)理尚未完全明確,目前無法有效治愈。研究表明,在OA患者的關(guān)節(jié)軟骨中,軟骨細(xì)胞和各種細(xì)胞外基質(zhì)均發(fā)生顯著的改變,由膠原和蛋白聚糖所組成的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)亦出現(xiàn)降解,從而導(dǎo)致了關(guān)節(jié)軟骨的進(jìn)一步退化。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)膝OA和正常人關(guān)節(jié)軟骨中X型膠原的檢測(cè),分析OA患者X型膠原的表達(dá)特征,以探討X型膠原在膝骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展中所起的作用。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本情況

收集行人工膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者的軟骨標(biāo)本18例,所有病例均排除繼發(fā)性O(shè)A或類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等其他關(guān)節(jié)疾病,確診為原發(fā)性O(shè)A(診斷標(biāo)準(zhǔn)參考美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1995年版指南),其中女14例,男4例,平均年齡 68.3歲(61～79歲)。正常對(duì)照組13例 ,女性9例 ,男性4例 ,平均年齡65.1歲(57～81歲),來源于大腿及以上部位截肢術(shù)患者或捐獻(xiàn)的新鮮尸體,均無關(guān)節(jié)疾患。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HE染色:各組標(biāo)本取下后,去除碎屑,生理鹽水沖洗,仔細(xì)觀察大體情況,取部分做HE染色,其余標(biāo)本置于-70℃凍存待用。

1.2.2 總RNA抽提:將軟骨組織塊充分剪碎,PBS洗滌,加入0.2%的Ⅱ型膠原酶/0.1%透明質(zhì)酸酶的DMEM溶液中,于37℃震蕩消化4～6 h,500 g離心獲取軟骨細(xì)胞。取軟骨細(xì)胞加入Trizol(GIBCO BRL)中,按照實(shí)驗(yàn)說明抽提總RNA。余下細(xì)胞冷凍備用。

1.2.3 RT-PCR:按照試劑盒說明,將mRNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA(2 μ L RNA/20 μ L 體系 ,TaKaRa AMV Reverse Transcriptase XL)。以得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)(TaKaRa Taq),以βactin為內(nèi)標(biāo)基因。X型膠原的引物序列如下:正義鏈 5′-TGGGTAGGCCTGTATAAAGAACGG-3′;反 義 鏈 5′ -CATGGGAGCCACTAGGAATCCTGAGA-3′。X型膠原基因擴(kuò)增反應(yīng)條件:94℃變性5 min,94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,反復(fù)循環(huán),最后72℃延伸10 min。產(chǎn)物的片段長度為210 bp。

1.2.4 Northern 雜交:取總 RNA 樣本 20 μ g左右,在含有2.2 mol/L甲醛的1%瓊脂糖凝膠中50 V電泳6 h左右。電泳完畢后,凝膠用DEPC水稍加淋洗,毛細(xì)洗脫法將RNA樣品轉(zhuǎn)移至尼龍膜,具體步驟按照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行。尼龍膜以0.12 J/cm2紫外線照射交聯(lián)。取100～200 ng探針片段,以32 P標(biāo)記,加入到10 mL雜交液(CLONTECH)中,與尼龍膜68℃雜交過夜。次日,將尼龍膜置于 100 mL 1×SSC(20×SSC:3 mol/L NaCl,0.3 mol/L枸櫞酸鈉)/0.1%SDS中,42℃漂洗20 min;再用100 mL 0.2×SSC/0.1%SDS稍加漂洗。最后,磷屏顯影,進(jìn)行光密度分析。

1.2.5 Western雜交:取預(yù)先留存的軟骨細(xì)胞,加入蛋白裂解液提取細(xì)胞蛋白。采用Bio-Rad DC protein assay對(duì)總蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定后,取30 μ g總蛋白,加入5×上樣緩沖液,進(jìn)行體積分?jǐn)?shù)10%SDS-PAGE電泳,半干轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,0.05 kg/L脫脂奶粉封閉過夜后,以1∶2 000比例加入鼠抗人X型膠原抗體,室溫作用3 h,Tween20-PBS洗膜5 min×3次,二抗孵育 2 h,同上洗膜3次后,ECL(Amersham)化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光,X線片曝光,顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析,設(shè)定P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 OA軟骨的組織學(xué)特征

與正常對(duì)照關(guān)節(jié)軟骨相比,病變軟骨無光澤,呈淡黃色,表面粗糙,有大小不一的軟骨碎裂剝脫,軟骨下骨暴露,部分有潰瘍形成。HE染色顯示軟骨基質(zhì)纖維變性,部分細(xì)胞增殖活躍,存在簇聚現(xiàn)象。

2.2 RT-PCR檢測(cè)X型膠原表達(dá)

RT-PCR檢測(cè)X型膠原的結(jié)果發(fā)現(xiàn),OA患者的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中X型膠原在mRNA水平有顯著升高。進(jìn)一步對(duì)RT-PCR的結(jié)果進(jìn)行光密度分析,可以發(fā)現(xiàn)OA組的collagen-X/β-actin的比值與正常對(duì)照的差異有顯著性(P<0.05)。

2.3 Northern雜交檢測(cè)X型膠原表達(dá)

Northern檢測(cè)結(jié)果顯示,在OA組的關(guān)節(jié)軟骨中X型膠原的表達(dá)水平非常顯著地高于正常對(duì)照組(P<0.01),OA組平均水平達(dá)到對(duì)照組的2.40倍。

2.4 Western雜交檢測(cè)X型膠原含量

在蛋白水平,Western雜交檢測(cè)結(jié)果提示,OA患者的關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中X型膠原的含量,與正常對(duì)照組相比顯著升高(P<0.01),有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.5 X型膠原mRNA和蛋白表達(dá)變化的相關(guān)性分析

將各例OA患者的RT-PCR、Northern雜交與Western雜交結(jié)果,通過Pearson相關(guān)性分析,最終顯示mRNA與蛋白水平的X型膠原的表達(dá)水平的變動(dòng)并不具有顯著的相關(guān)性(P>0.05)。

3 討 論

在正常關(guān)節(jié)的透明軟骨中,由Ⅱ、Ⅸ和Ⅺ型各種不同的膠原纖維交聯(lián)成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)提供其必要的組織強(qiáng)度和順應(yīng)力[1]。X型膠原是一種短鏈的非纖維性膠原,由三條相同的α 1鏈組成三聚體,正常存在于軟骨化骨中心及骨骺軟骨生長板內(nèi)的軟骨細(xì)胞周圍的基質(zhì)中。X型膠原可以形成柵格狀的結(jié)構(gòu),并與Ⅱ型膠原纖維發(fā)生聯(lián)系,影響關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度[2]。

骨關(guān)節(jié)炎是老年人最常見的慢性關(guān)節(jié)疾病,其發(fā)病過程中最主要的特點(diǎn)是關(guān)節(jié)軟骨的進(jìn)行性丟失[3]。在OA患者的關(guān)節(jié)軟骨中,軟骨細(xì)胞自身的生長和增殖,及其基質(zhì)的合成和代謝均出現(xiàn)紊亂[4]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,無論是在mRNA水平還是在蛋白水平,OA患者的關(guān)節(jié)軟骨中X型膠原的表達(dá)都要顯著的高于正常對(duì)照組。在OA患者的關(guān)節(jié)腔中,由于炎癥反應(yīng)的進(jìn)行,存在各種細(xì)胞因子,如IL-1β和 TNF-α等[5-7]。分解性細(xì)胞因子和合成性細(xì)胞因子之間的平衡維持著軟骨基質(zhì)合成代謝和分解代謝的平衡,二者比例的失衡是OA軟骨基質(zhì)的降解和破壞的重要原因[8-9]。當(dāng)周圍的生化條件發(fā)生改變,OA的關(guān)節(jié)軟骨中,軟骨細(xì)胞會(huì)失去正常表型,轉(zhuǎn)化成肥大軟骨細(xì)胞,不再表達(dá)Ⅱ型膠原,轉(zhuǎn)而大量合成X型膠原。在很多的臨床病例中,都發(fā)現(xiàn)OA的發(fā)生往往伴隨著X型膠原的合成和沉積,并且隨OA的病變過程,X型膠原的陽性表達(dá)會(huì)擴(kuò)展向軟骨表面的纖維化區(qū)和骨贅形成的區(qū)域[10]。

經(jīng)本實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,我們又發(fā)現(xiàn)在膝OA的關(guān)節(jié)軟骨中,X型膠原在mRNA和蛋白水平表達(dá)的變化情況并沒有顯著的相關(guān)性。這種不一致性,我們認(rèn)為主要是因?yàn)镺A關(guān)節(jié)軟骨中細(xì)胞凋亡與基質(zhì)降解的不同步性造成的。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),既沒有mRNA的合成,又在酶的催化作用下使原有的mRNA等生物大分子迅速降解。但與此同時(shí),細(xì)胞外的X型膠原蛋白并不會(huì)像mRNA那樣急速的分解,因而,在各個(gè)具體的OA關(guān)節(jié)軟骨中,X型膠原的mRNA和蛋白水平表達(dá)的狀況并不是同步的。

本實(shí)驗(yàn)的Northern雜交與RT-PCR結(jié)果的差別提示我們,Northern雜交是一種更為精確和可信的半定量檢測(cè)方法。由于RT-PCR歷經(jīng)了2步酶反應(yīng),其間的平臺(tái)效應(yīng)可能會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[11]。

在臨床中,OA一般常見于老年人群,是一種較為普遍的老年性疾病。在老化過程中,軟骨細(xì)胞合成Ⅱ型膠原和X型膠原的能力逐漸變化,令基質(zhì)中Ⅱ型/X型膠原的比例不斷降低。當(dāng)膝OA發(fā)生后,半月板顯示有相當(dāng)程度的崩解與中心的骨化,四周的軟骨基質(zhì)強(qiáng)烈表達(dá)X型膠原,且由于結(jié)構(gòu)松散易被水解。而軟骨中的膠原代謝率極低[12],當(dāng)外周的基質(zhì)被水解后,軟骨細(xì)胞直接與炎癥反應(yīng)中的各種細(xì)胞因子接觸,大量凋亡,更加無法補(bǔ)償被破壞的胞外基質(zhì),從而使OA的病癥進(jìn)一步惡化。

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