蕪菁籽中總黃酮含量測(cè)定的方法學(xué)研究

馬合木提·買買提明，瑪爾哈巴·吾斯?jié)M，賽力慢·哈得爾，米麗班·霍加*

（1.新疆醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆師范大學(xué)科研處化學(xué)化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054）

蕪菁籽為十字花科（Cruciferous）植物蕪菁（Brassica rapa）干燥成熟的種籽。蕪菁籽具有清肝明目，利濕退黃，破積通淋的功效[1]。蕪菁籽還是維吾爾族醫(yī)藥中常用的族藥之一，以蕪菁籽油為藥用，與中醫(yī)中藥中蕪菁籽的用法不同，維吾爾族醫(yī)中常以蕪菁籽治療黃疸性肝炎，補(bǔ)腎生精，健胃消食，散風(fēng)利尿，性功能減退，尿路結(jié)石，可去除雀斑和皺紋，固法解毒作用等功效，且具有高效，低毒副作用的優(yōu)勢(shì)[2-3]。采用超聲-微波協(xié)同提取蕪菁籽中總黃酮，為其開發(fā)利用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

超聲-微波聯(lián)用萃取儀：上海新拓微波溶樣測(cè)試有限公司生產(chǎn)；UV-1100紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；AR1140電子天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；FW177型中草藥粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有公司。

蕪菁籽采自新疆阿克蘇地區(qū)柯坪縣。

蘆丁對(duì)照品（批號(hào)110080-200707）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；95%vol乙醇，氫氧化鈉，亞硝酸鈉，硝酸鋁，石油醚等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品10.00mg，置50mL容量瓶中，加20mL 65%vol乙醇，超聲處理溶解，定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液（0.20mg/mL），放入冰箱備用[4]。

1.2.2 樣品中總黃酮類化合物的提取

將干凈蕪菁籽放入80℃烘箱中烘干，再用粉碎機(jī)粉碎，取一定量的粉末于1000mL燒杯中，以1:50比例加入石油醚，攪拌30min后浸泡24h，旋轉(zhuǎn)蒸餾除去石油醚脫脂，抽濾，濾渣經(jīng)自然揮干石油醚后，備用。準(zhǔn)確稱取濾渣5g，置于具塞三角瓶中，加入一定量65%vol的乙醇，在一定條件下，超聲處理40min，離心分離，過濾除渣，用65%vol乙醇定容至250mL容量瓶中，作為待測(cè)儲(chǔ)備液。

1.2.3 最大吸收波長(zhǎng)的確定精確[5-6]

量取蘆丁對(duì)照品溶液2.0mL（0.20mg/mL），置于25mL容量瓶中，分別加入8mL 65%vol乙醇和1mL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻，放置6min；加入1mL10%硝酸鋁溶液，混勻，放置6min；再加10mL 5%氫氧化鈉溶液，搖勻后用65%vol乙醇定容至25mL，放置15min后，用空白試劑作參比，在波長(zhǎng)250nm～600nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

圖1 樣品和蘆丁的吸收曲線Fig.1 Absorption curve of samples and rutin

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

依據(jù)藥典中規(guī)定的測(cè)定總黃酮的常規(guī)方法進(jìn)行測(cè)定。精確量取蘆丁對(duì)照品溶液0、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL分別置于25mL容量瓶中，照“1.2.3”的方法顯色后，在波長(zhǎng)510nm處測(cè)定其吸光度值，用空白試劑作參比。

表1 蘆丁對(duì)照液濃度與吸光度值Table 1 Concentration and absorbency of standard rutin solutions

1.2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液3.0mL共6份，分別置于25mL量瓶中，按“1.2.3”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定吸光度值，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密量取“1.2.2”項(xiàng)中配制的待測(cè)儲(chǔ)備液10mL轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中乙醇定容，從中取5mL待測(cè)液于25mL容量瓶中定容后，按“1.2.3”項(xiàng)上方法顯色，在波長(zhǎng)510nm處每隔10min測(cè)定一次吸光度值，共測(cè)定6次，觀察吸光度的變化情況，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取5份“1.2.2”項(xiàng)中油醚脫脂后的濾渣5g，置于5個(gè)具塞三角瓶中，各加一定量的乙醇（65%vol），超聲處理40min，離心分離，過濾除渣，用65%vol乙醇定容至5個(gè)250mL容量瓶中，作為儲(chǔ)備液備用。每份移取10mL定容于100mL的5個(gè)容量瓶中。各取5mL置于25mL容量瓶，按“1.2.3”項(xiàng)上方法顯色后，以空白試劑為參比，在波長(zhǎng)510nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.8 加樣回收率試驗(yàn)

上一個(gè)實(shí)驗(yàn)中配制的已知含量的5份儲(chǔ)備液中，各取1mL置于25mL容量瓶中，每份精確加入0.5mg蘆丁對(duì)照品，用65%vol乙醇溶解定容，照“1.2.3”的方法顯色，測(cè)定每份樣品的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線

從蘆丁對(duì)照品溶液和待測(cè)液的掃描圖1可知，二者均在波長(zhǎng)510nm處有吸收，并此處的干擾小，故以510nm為測(cè)定波長(zhǎng)較合理。以蘆丁對(duì)照品溶液的濃度對(duì)吸光度值作圖，可得標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。由圖2可知，蘆丁對(duì)照品溶液的回歸方程為A=10.089c-0.0019，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9991，表明蘆丁在0.01mg/mL～0.05mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of rutin

2.2 精密度結(jié)果

由表2可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.31%，表明儀器精密度良好。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of precision test

2.3 穩(wěn)定性結(jié)果

圖3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Result of stability test

由圖3可知，10min～40min范圍之內(nèi)，樣品溶液穩(wěn)定性較好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.48%。

2.4 重復(fù)性結(jié)果

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of repetitive experiment

從表3可知，該測(cè)定方法的重現(xiàn)性良好，測(cè)得RSD=1.32%。

2.5 加樣回收率試驗(yàn)

表4 樣品加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 4 The average recovery experiment

由表4結(jié)果可知，樣品的平均回收率為99.66%且RSD小于1%，故認(rèn)為用上述方法測(cè)定蕪菁籽中總黃酮含量完全可行。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從方法學(xué)的角度探討了蕪菁籽中總黃酮含量測(cè)定方法的可信性。采用分光光度法分別測(cè)定了蕪菁籽中總黃酮的含量，在精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)和回收率試驗(yàn)結(jié)果中相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值都符合要求。說明測(cè)定儀器精密度良好，測(cè)定時(shí)間內(nèi)樣品的穩(wěn)定性可靠，測(cè)量結(jié)果的重復(fù)性好，加樣回收率試驗(yàn)的平均回收率達(dá)99.66%，方法準(zhǔn)確可行，結(jié)果表明此方法可適用于蕪菁籽中總黃酮含量測(cè)定。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[2]尼米吐拉，買買提江，木塔力甫.維吾爾醫(yī)常用藥材[M].烏魯木齊：新疆人民衛(wèi)生出版社，2005：362.

[3]新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生廳.維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)[M].上冊(cè).烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1993（8）：123.

[4]楊國(guó)恩.超聲-微波協(xié)同輔助溶劑法提取喜樹果中黃酮化合物的研究[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2010，27（1）：27-29.

[5]李 莉，顏 杰.超聲-微波協(xié)同萃取桑葉總黃酮的工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（17）：9208-9210.

[6]李 莉，顏 杰.超聲-微波協(xié)同萃取桂花葉總黃酮的工藝研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（1）：306-308.