鮮切蓮藕中植物乳桿菌生長預(yù)測模型研究

王宏勛，趙國嬌，方蘭蘭

（武漢工業(yè)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

鮮切果蔬指經(jīng)過精選、整理、清洗、切割、殺菌、包裝等處理而制成直接烹飪或直接食用的成品果蔬[1]。加工過程中，由于細(xì)胞組織受損，更易引起微生物的污染[2]，微生物的變化成為產(chǎn)品營養(yǎng)、感官品質(zhì)下降的主要原因之一[3-5]。蓮藕組織脆嫩、口感爽滑、營養(yǎng)價值高、市場需求大等特點適合鮮切加工。目前，利用不同的動力學(xué)模型對不同的生鮮及加工食品的品質(zhì)變化研究較多[6-9]，形成了相應(yīng)的預(yù)測模型[10-14]。但對鮮切蓮藕中占主要優(yōu)勢的植物乳桿菌的品質(zhì)變化及食品貨架期預(yù)測方面的研究卻少有報道。本文以鮮切蓮藕中分離的植物乳桿菌為研究對象，研究其在鮮切蓮藕的生長預(yù)測模型，為鮮切蓮藕的品質(zhì)評價與貨架期預(yù)測模型的建立提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品

蓮藕：（購于武商量販常青花園店，東西湖區(qū)如意情農(nóng)場）：選取白色，無腐爛變質(zhì)，藕節(jié)完整的蓮藕，剔除損傷、褐變或有病蟲害的藕段。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

胰蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；酵母浸膏：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；葡萄糖：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；瓊脂：福建省仙游縣榜頭調(diào)味品廠；氯化鈉（優(yōu)級純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；假單胞分離瓊脂（Pseudomonas Isolation Agar）、VRBA瓊脂（Violet Red Bile Agar）、MRS瓊脂（Man Rogosa and Sharpe Agar）、MSA瓊脂（Mannitol Salt Agar）：島高科技園海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器和設(shè)備

FA2104N電子天平：上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；H.H.s電熱恒溫水浴鍋：上海滬南科學(xué)儀器聯(lián)營廠；GZX-9070型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TC-400B真空包裝機(jī)：上海星貝包裝機(jī)械有限公司；101A-3數(shù)顯電子鼓風(fēng)干燥箱：上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；YX280B手提式蒸汽壓力滅菌器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；SWCJ.A智能控制型超凈工作臺：上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；250B生化培養(yǎng)箱：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；LRH-100C型低溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LRH-150-S恒溫恒濕培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏試驗設(shè)備有限公司；YXQ·SG41·280電熱手提壓力蒸汽消毒器：上海醫(yī)用核子儀器廠；FSH-2A可調(diào)高速勻漿機(jī)：金壇市醫(yī)療儀器廠；真空包裝機(jī)TC-400B上海星貝包裝機(jī)械有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 蓮藕中菌相變化規(guī)律的研究及優(yōu)勢菌的確定

本實驗采用選擇性培養(yǎng)基對細(xì)菌總數(shù)、假單胞菌屬、腸桿菌科、乳酸菌、金黃色葡萄球菌以及霉菌和酵母進(jìn)行平板計數(shù)。具體操作：在無菌操作條件下，取25g樣品放入225mL滅菌生理鹽水（濃度為0.9%）中進(jìn)行稀釋，之后用1.0mL滅菌吸管加入含有9.0mL生理鹽水試管中進(jìn)行10倍遞增稀釋，吸取1:10稀釋液1mL，注入含有9.0mL無菌水的試管中，振搖試管混勻，作成1:100的稀釋液，依次類推[15]。根據(jù)儲存期的不同，選取3個合適的稀釋度，每一稀釋度取1mL吹入培養(yǎng)皿中。將冷卻至45℃左右的不同的培養(yǎng)基倒入平皿內(nèi)在水平位置上搖勻，待凝固后倒置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計數(shù)。計算平板內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得每克樣品所含菌落總數(shù)（單位為cfu/g）。記錄每次測量的數(shù)據(jù)。

1.4.2 腐敗限控量的確定

為了精確預(yù)測蓮藕的貨架壽命，必須確定蓮藕的優(yōu)勢腐敗菌以及最小腐敗量（Ns），即蓮藕品鮮度遭到感官拒絕時的特定腐敗菌數(shù)量。本實驗選擇10位評定人員組成評定小組對蓮藕的褐變程度、氣味指標(biāo)和組織指標(biāo)，來評定蓮藕的腐敗狀況。5分為商品界限，以下為不可接受[16]。

1.4.3 不同溫度下植物乳桿菌的生長曲線

本試驗主要研究冷藏溫度對菌株生長速率的影響。分別取0℃、4℃、10℃、15℃和20℃條件下儲藏的蓮藕，按照1.4.1中無菌操作方法用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行平板計數(shù)。

1.4.4 一級模型擬合

應(yīng)用統(tǒng)計軟件（SAS 9.1），將實驗測定的某一溫度條件下微生物的時間和對應(yīng)的微生物數(shù)量，用Gompertz模型擬合其生長動態(tài)[17]。這是一個非線性的微生物生長模型，表達(dá)式：

式中：e 為2.7182；N0為初始菌數(shù)對數(shù)值，lg（cfu/g）；C 為隨時間無限增加時菌增量的對數(shù)值，lg（cfu/g）；B 為在時間為M 時的相對最大比生長速率，d-1；M 為達(dá)到相對最大生長速率所需要的時間，d。

1.4.5 二級模型擬合

同樣利用SAS 統(tǒng)計軟件擬合二級模型，該模型研究溫度對一級模型參數(shù)的影響，并用平方根模型擬合溫度—生長速率平方根曲線。平方根模型是常用來描述溫度對微生物生長的影響[18]。將一級模型求得參數(shù)帶入（2）和（3）求出最大比生長速率U和遲滯期LPD，再把U、LPD和對應(yīng)的溫度變量代入方程式（4）和（5），擬合出b、Tmin值。將所得參數(shù)值b和Tmin代回原等式，即可得到二級模型。

注：b、Tmin是模型待求的參數(shù)，T 是培養(yǎng)溫度；TminU、TminL是理論上的最小生長溫度，是微生物沒有代謝活動時的溫度是通過外推回歸線與溫度軸相交而得到的溫度，其實際值要低于微生物培養(yǎng)基的冰凍點；b 是斜率。

1.4.6 微生物生長動力學(xué)模型驗證和預(yù)測模型的可靠性評價

ROSS T等[19-20]提出了用偏差度（bias factor）Bf和準(zhǔn)確度（accuracy factor）Af來判定模型精確度。將植物乳桿菌生長動力學(xué)模型求得的預(yù)測值與實驗所得的植物乳桿菌生長的數(shù)值帶入下式即可求得偏差度與準(zhǔn)確度。

式中：Npredicted為預(yù)測數(shù)值，Nobserved為實測數(shù)值，n 為實驗次數(shù)。

1.4.7 貨架期預(yù)測模型的建立和驗證

0～20℃儲藏植物乳桿菌剩余貨架期根據(jù)建立的植物乳桿菌生長動力學(xué)模型，就可以用由植物乳桿菌從初始菌數(shù)增加到腐敗限控量所需要的增殖時間來預(yù)測其貨架期。

注：式（6）是在式（1）的基礎(chǔ)上推導(dǎo)出來。Nmax是穩(wěn)定期的最大菌數(shù)，Ns 是達(dá)到腐敗限控量時的微生物數(shù)量。將7℃儲藏蓮藕實驗得到的貨架期與模型預(yù)測的貨架期進(jìn)行比較，驗證貨架期預(yù)測模型的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓮藕中菌相變化規(guī)律的研究及優(yōu)勢菌的確定

用不同的選擇性培養(yǎng)基，對4℃儲藏的蓮藕的菌相變化規(guī)律進(jìn)行了研究，結(jié)果見圖1。在整個儲藏過程中，細(xì)菌總數(shù)、植物乳桿菌、假單胞菌屬、霉菌和酵母都呈增加趨勢，腸桿菌科和金黃色葡萄球菌在初始菌相中占有較大比例，可能在后期由于對特殊環(huán)境不適應(yīng)，在生長過程中處于下降趨勢。在儲藏的第一天金黃色葡萄球菌和腸桿菌科數(shù)量減少，可能是鮮切蓮藕中的這些不能耐受低溫，生長被抑制甚至死亡。在整個儲藏過程中，蓮藕最初受到多種微生物的污染，但是植物乳桿菌的數(shù)量和生長趨勢都接近菌落總數(shù)，是整個過程中的優(yōu)勢菌。

圖1 4℃蓮藕菌相變化規(guī)律Fig.1 Changes of the microflora in lotus root at 4℃

2.2 腐敗限控量的確定

在儲藏期間，優(yōu)勢腐敗菌的生長比其他微生物快[21]。確定蓮藕的優(yōu)勢腐敗菌以及最小腐敗量（Ns）就可以在腐敗范圍（特定腐敗菌導(dǎo)致蓮藕腐敗的內(nèi)外環(huán)境條件的范圍）內(nèi)，建立優(yōu)勢腐敗菌的生長動態(tài)模型，然后應(yīng)用該模型預(yù)測蓮藕的質(zhì)量和貨架期。

由表1可知，在第6d的時候達(dá)到感官拒絕點，蓮藕變黃并且有水漬狀出現(xiàn)。此時菌落總數(shù)達(dá)到107.32cfu/g，植物乳桿菌數(shù)量為106.77cfu/g。因此把106.77cfu/g確定為蓮藕的腐敗限控量。

表1 4℃蓮藕感官指標(biāo)的變化Table 1 Sensory indicators of lotus root at 4℃

2.3 不同溫度下植物乳桿菌的生長曲線

繪制在不同溫度條件下植物乳桿菌的t-lgNt曲線，得到在不同溫度條件下的生長曲線，見圖2。

圖2 不同溫度植物乳桿菌生長曲線Fig.2 Growth curves of Lactobacillus plantarum at different temperatures

溫度對微生物的生長有明顯的影響。植物乳桿菌在0℃和4℃時生長明顯較慢，生長曲線不呈典型的S型。到10℃、15℃和20℃時生長速度明顯加快，在后期都有停止甚至減少的趨勢，可能是營養(yǎng)物質(zhì)減少或種群內(nèi)競爭引起的。不同溫度條件下進(jìn)入對數(shù)期的時間不同。由以上可以看出，溫度是影響熱植物乳桿菌生長的一個重要因子。

2.4 植物乳桿菌生長動力學(xué)模型的擬合及其驗證

2.4.1 一級模型的擬合

Gompertz方程是一個非線性的微生物生長模型，被認(rèn)為是較為準(zhǔn)確擬合微生物生長的一級模型[21]。利用SAS9.1軟件，對鮮切蓮藕在0、4℃、10℃、15℃和20℃下儲藏期間的植物乳桿菌生長動態(tài)變化進(jìn)行擬合，得到不同儲藏溫度下生長曲線得到的參數(shù)見表2，此時能更清楚地描述溫度對植物乳桿菌的影響。隨著溫度的升高，最大比生長速率U逐漸增大，0℃為0.523d-1，而20℃時則迅速增大為4.2996d-1，增大了8倍。溫度對于遲滯期的影響，總的來說是隨溫度的升高而遲滯期縮短。但遲滯期隨溫度變化的規(guī)律性不如生長速率隨溫度的變化。觀察上表，所有函數(shù)方程擬合出的相關(guān)系數(shù)R2值都較高，說明所建立的模型都能很好表述出蓮藕在不同溫度儲藏條件下植物乳桿菌的生長變化規(guī)律。

表2 不同溫度植物乳桿菌的生長動力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of Lactobacillus plantarum at different temperatures

將表中的參數(shù)（N0、B、C和M）代入Gompertz模型中，即可得到植物乳桿菌在不同溫度下生長的一級模型，結(jié)果如下：

表3 不同溫度植物乳桿菌菌的生長動力學(xué)模型Table 3 Growth kinetics model of Lactobacillus plantarum at different temperatures

2.4.2 二級模型的擬合

二級模型（平方根模型）能描述溫度的變化對菌落生長的影響。由圖3和圖4可見，溫度與比生長速率，溫度與延滯期呈良好的線性關(guān)系。將圖3和圖4數(shù)學(xué)表達(dá)式中的各項數(shù)值用具有生物學(xué)意義的參數(shù)來表示，得到植物乳桿菌 的bU=0.0678，TminU=-11.848，bL=0.0194，TminL=-30.051，得到相應(yīng)的溫度與比生長速率的模型為（-11.848）]和溫度與延滯期的模型為（-30.051）]。

圖3 溫度與比生長速率的關(guān)系Fig.3 Relationship between temperature and specific growth rate

圖4 溫度與延滯期的關(guān)系Fig.4 Relationship between temperature and lag phase

2.4.3 模型的驗證

準(zhǔn)確度是衡量預(yù)測值和實測值之間的差異，偏差度用來檢查預(yù)測值的上下波動幅度。準(zhǔn)確因子的值越大表明預(yù)測效果越差，當(dāng)偏差度和準(zhǔn)確度值為1時預(yù)測效果最為理想。通過SAS統(tǒng)計軟件求得植物乳桿菌總數(shù)的預(yù)測值，與前面求得的各個溫度下的觀測值見圖5～圖9，由圖可以看出預(yù)測值與實測值基本重合。由表4可見，偏差度在0.877～1.1912之間，準(zhǔn)確度在0.9776～1.2567之間，這個驗證結(jié)果表明，0℃～20℃范圍恒溫條件下建立的數(shù)學(xué)模型能較好地預(yù)測植物乳桿菌在不同溫度下的生長動態(tài)。

圖5 0℃植物乳桿菌預(yù)測的與實測的生長曲線Fig.5 Observed and predicted growth curves of Lactobacillus plantarumon at 0℃

圖6 4℃植物乳桿菌預(yù)測的與實測的生長曲線Fig.6 Observed and predicted growth curves of Lactobacillus plantarumon at 4℃

圖7 10℃植物乳桿菌預(yù)測的與實測的生長動曲線Fig.7 Observed and predicted growth curves of Lactobacillus plantarumon at 10℃

2.5 剩余貨架期的預(yù)測與驗證

由表1已知，在0～20℃溫度范圍蓮藕中植物乳桿菌的腐敗限控量為106.77cfu/g，各溫度下達(dá)到穩(wěn)定期的最大菌數(shù)的平均值108.584cfu/g。將測得的初始菌數(shù)帶入式（6），可得到0℃～20℃儲藏蓮藕的的剩余貨架期。

圖8 15℃植物乳桿菌預(yù)測的與實測的生長曲線Fig.8 Observed and predicted growth curves of Lactobacillus plantarumon at 15℃

圖9 20℃植物乳桿菌預(yù)測的與實測的生長曲線Fig.9 Observed and predicted growth curves of Lactobacillus plantarumon at 20℃

表4 準(zhǔn)確度和偏差度驗證預(yù)測模型Table 4 Evaluation of predict model using bias factors and accuracy factors

計算得7℃儲藏蓮藕的剩余貨架期為5.892d，實測值為6.0d相對誤差為1.8%。表明預(yù)測模型能夠快速可靠的預(yù)測0～20℃儲藏蓮藕的剩余貨架期。

3 結(jié)論

1）測定4℃條件下蓮藕的菌相變化，確定出植物乳桿菌是鮮切蓮藕腐敗過程中的優(yōu)勢菌。測定植物乳桿菌在不同溫度下數(shù)量變化情況和進(jìn)行感官評定，得出蓮藕中植物乳桿菌的腐敗限控量為106.77cfu/g，各溫度下達(dá)到穩(wěn)定期的最大菌數(shù)的平均值為108.584cfu/g。

2）利用Gompertz模型能很好地擬合植物乳桿菌的生長變化，判定系數(shù)R2的值均在0.98以上，具有較高的擬合精確度。利用平方根模型，得到植物乳桿菌生長的二級模型，判定系數(shù)R2的值均在0.98以上，模型的偏差度和準(zhǔn)確度平均為1.0125和1.1006，表明方程能較好的描述該溫度范圍內(nèi)植物乳桿菌與最大比生長速率和延滯期之間的關(guān)系。

3）建立了蓮藕在0～20℃溫度儲藏過程中的貨架期預(yù)測模型，用7℃蓮藕中植物乳桿菌生長的實測值與通過貨架期預(yù)測模型得到的預(yù)測值進(jìn)行比較，相對誤差為1.8%，表明模型可以可靠預(yù)測0～20℃溫度區(qū)域內(nèi)蓮藕的貨架期。

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