野薔薇根中熊果酸的提取工藝研究

努爾皮達(dá)·阿卜拉江，其買古麗·阿沙木，迪麗努爾·馬里克*

（新疆師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,新疆 烏魯木齊 840054）

熊果酸（Ursolic acid）又名烏蘇酸、烏索酸、α-香樹脂醇，是一種弱酸性五環(huán)三萜類化合物[1]。熊果酸純品為白色針狀結(jié)晶（乙醇中結(jié)晶），味苦，具有多種生物活性，有鎮(zhèn)靜、抗炎、抗菌、降低血糖、抗肝炎[2]等多種生物學(xué)效應(yīng)，熊果酸還具有明顯的抗氧化功能[3]，所以是一種很有開發(fā)價值的植物活性成分，被廣泛地用作醫(yī)藥和化妝品原料。日本等國家已經(jīng)將其作為天然抗氧化劑應(yīng)用于食品中[3]。新疆野薔薇（Rosa spp）富含多種人體所需的營養(yǎng)物質(zhì)[4-5]，有較大開發(fā)利用價值，現(xiàn)代研究證明，野薔薇中含有熊果酸、齊墩果酸等三萜類化合物[6]。本文以野薔薇果皮為原料，采用超聲波法提取熊果酸，通過研究優(yōu)化該方法工藝條件，旨在提高熊果酸產(chǎn)率，為進(jìn)一步開發(fā)利用野薔薇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

野薔薇根：采自阿勒泰縣，粉碎，過篩，備用。

熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號110709-200304）；甲醇（色譜純）；超純水；乙醇（分析純）。

高效液相色譜儀（安捷倫1200LC，美國），色譜柱（安捷倫公司HC-C184.6×150mm，粒徑為5μm），JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機（波新芝生物科技股份有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 超聲波提取樣品液的制備

精密稱取野薔薇根粉末2g，按一定料液比，加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇，浸泡4h，于不同超聲頻率、不同功率條件下超聲處理不同時間，靜置放冷，濾過，重復(fù)2次，合并濾液，回收溶劑至干，殘渣用甲醇溶解定溶于50mL容量瓶中，作為測試樣品。

1.2.2 熊果酸提取率的測定方法

色譜條件：AgilentHC-C18（4.6mm×150mm，粒徑為5μm）色譜柱；流動相為甲醇:水=50:50；流速0.5mL/min；檢測波長為278nm；柱溫室溫；進(jìn)樣量為10μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取干燥至恒重的熊果酸對照品3.3mg，置于5mL容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，得含熊果酸0.66mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，置4℃冰箱中保存。用母液依次配置濃度為528μg/mL、396μg/mL、264μg/mL、132μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣10μL，測定峰面積。以峰面積平均值為縱坐標(biāo)，其對應(yīng)進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸計算，得線性方程為y=39.197x-850.99，相關(guān)系數(shù)（R2=0.9977）。熊果酸濃度為132μg/mL～528μg/mL，線性關(guān)系良好。

精密度實驗：精密吸取熊果酸對照品溶液（528μg/mL）10μL，進(jìn)樣，連續(xù)測定5次，測定熊果酸對照品峰面積的RSD為1.62%（n=5），結(jié)果表明儀器精密度良好。

加樣回收率試驗：精密稱取已知含量的野薔薇果皮0.20g，共5份，分別精密加入一定量的熊果酸對照品，按供試品溶液制各方法制備，采用上述色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果表明，其平均回收率為101.8%。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n=5）Table 1 Result of recovery rate

1.2.3 樣品測定

取測試樣品用0.45μm微孔濾膜過濾，精密吸取10μL，按上述色譜條件進(jìn)行測定。重復(fù)進(jìn)樣3次，取均值，根據(jù)回歸方程計算熊果酸的量。

1.2.4 樣品的定性

（1）在相同的色譜條件下，將樣品色譜圖與對照品溶液色譜圖進(jìn)行對照，根據(jù)保留時間確定樣品中的熊果酸；（2）在樣品中加入熊果酸的對照品溶液，根據(jù)峰高的突增來進(jìn)一步驗證色譜峰的歸屬，通過以上2種方法，對樣品液的色譜峰定性。樣品液的色譜圖見圖2。

圖1 熊果酸對照品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard ursolic acid

圖2 熊果酸樣品HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of sample ursolic acid

1.2.5 野薔薇根中熊果酸提取工藝優(yōu)化

正交試驗因素水平設(shè)計：根據(jù)已有的資料和實際情況，選用提取時間（A）、超聲頻率（B）、超聲功率（C）和料液比（D）作為考查因素，以野薔薇果皮中熊果酸的提取效率為考查指標(biāo)，選用L9（34）正交表，因素水平見表2。

表2 正交試驗因素及水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

用HPLC法測定樣品中熊果酸的含量（以每g野薔薇果皮中含熊果酸mg計）的結(jié)果見表3。

表3 L9(34)正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of L9(34) orthogonal test

表4 正交試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of the orthogonal test

由試驗結(jié)果并通過極差R的大小可知，各試驗因素對熊果酸提取率影響的大小次序為B＞A＞D＞C，即對野薔薇果皮中熊果酸提取影響最大的因素是超聲頻率，超聲功率和料液比影響次之，超聲時間影響最小。最佳提取工藝條件為A3B1C3D2，即超聲功率為600W，超聲頻率為工作5s、間歇5s，料液比1:25，提取時間為30min。

2.2 正交試驗結(jié)果的驗證

按2.1正交試驗的最佳工藝條件進(jìn)行1.2.1試驗，平行3次，取平均值，得最佳提取條件下熊果酸的提取率為2.426 mg/g。

3 結(jié)論

野薔薇根中熊果酸的最佳提取工藝參數(shù)：超聲功率為600W，超聲頻率為工作5s、間歇5s，料液比2:25，提取時間為30min。在最優(yōu)因素水平組合條件下，熊果酸提取率為2.426mg/g。

超聲輔助提取野薔薇果皮中熊果酸主要是利用超聲波的空化作用，即一定頻率的超聲波對細(xì)胞的破化有助于有效成分的溶出，另外超聲波的次級效應(yīng)，如機械振動、乳化、擴散、擊碎、化學(xué)效應(yīng)等也能加速欲提取成分的擴散釋放并充分與溶劑混合，有利于提取。

采用高效液相色譜法對熊果酸的含量進(jìn)行分析，建立了快速、簡便、靈敏的HPLC測定方法。

[1]孟艷秋，陳 瑜，王 丹.熊果酸的研究進(jìn)展[J].中國新藥雜志，2007，16（1）：25-27.

[2]王 鵬，等.熊果酸在藥用植物中的分布及藥理作用[J].中藥材，2000，29（6）：420.

[3]BALANEHRU S,NAGARAJAN B.Protective effect of oleanolic acid and ursolic acid against lipid peroxidation[J].Biochem Int,1991,24(5):981-984.

[4]梁頌華，周文革.新疆野薔薇果汁工藝研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，28（2）：84-86.

[5]杜英華，陳保國，賈洪斌.刺玫果營養(yǎng)成分的分析測定[J].內(nèi)蒙古石油化工，2002，28（4）：24-25.

[6]PANG NN,MALIKE D,LIU HW.Simultaneous determination of main bioactive components inRosa multifloraThunb.and their fragmentation study by LC-MS[J].Chromatographia,2009,70(7-8):1253.

[7]王春雷，蘆柏震.熊果酸抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J].安徽醫(yī)藥，2005，9（10）：723.

[8]劉增英.均勻設(shè)計在熊果酸提取工藝中的應(yīng)用[J].中藥材，2005，28（5）：425-427.

[9]孟瑞麗，馬登峰，劉 洪，等.高效液相色譜法測定木瓜中熊果酸的含量研究[J].西南師范大學(xué)學(xué)報，2010，35（5）：125-127.

[10]孔 陽，馬養(yǎng)民，李彥軍.超聲波法提取萬壽菊中葉黃素的工藝優(yōu)化[J].中國釀造，2009，28（10）：72-73.