大田軟海綿酸和鰭藻毒素-1純化樣品的分析

摘 要 采用高效液相色譜熒光檢測、高效液相色譜紫外檢測、流動(dòng)注射進(jìn)樣質(zhì)譜檢測和高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析等方法對從有毒利瑪原甲藻（Prorocentrum lima Dodge）中分離純化的大田軟海綿酸（OA）和鰭藻毒素1（DTX1）毒素樣品進(jìn)行定性鑒定和純度分析，為毒素標(biāo)準(zhǔn)品的制備提供材料和方法依據(jù)。通過柱前衍生、HPLCFLD分析，可在樣品中檢測到OA和DTX1與4溴甲基7甲氧基香豆素（BrMmc）的衍生物，表明樣品中存在OA和DTX1毒素。 HPLCUV方法在200 nm下的檢測結(jié)果表明，OA和DTX1是樣品色譜圖中主要的色譜峰，OA樣品和DTX1樣品純度可以達(dá)到95%和98%。根據(jù)正、負(fù)離子模式下流動(dòng)注射質(zhì)譜分析結(jié)果，毒素樣品和標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖中信號最強(qiáng)離子的m/z相同，應(yīng)為OA和DTX1毒素的\\＋和\\離子，其裂解方式也基本一致。通過HPLCMS方法，對樣品進(jìn)行了m/z 200～1000的全掃描分析，發(fā)現(xiàn)OA樣品中可檢測到少量雜質(zhì)，而DTX1樣品中僅檢測到DTX1毒素成分。分析結(jié)果表明，前期分離純化的OA和DTX1毒素樣品純度較高，可以在腹瀉性貝毒（DSP）毒素液相色譜和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析中用作標(biāo)準(zhǔn)毒素。

關(guān)鍵詞 腹瀉性貝毒； 大田軟海綿酸； 鰭藻毒素1； 高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用

1 引 言

大田軟海綿酸（OA）及其衍生物鰭藻毒素（DTXs）是一類親脂性聚醚類化合物，主要由鰭藻屬和原甲藻屬有毒甲藻產(chǎn)生\\。當(dāng)有毒微藻被雙殼貝類濾食后，OA和DTXs毒素會在貝類消化腺內(nèi)累積。貝類中沾染的OA和DTXs毒素是導(dǎo)致腹瀉性貝毒中毒（DSP）的主要毒素成分\\。食用染毒貝類后，患者會出現(xiàn)腹瀉、嘔吐等急性中毒癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，OA和DTX1引起成人出現(xiàn)中毒癥狀的最小劑量約為40和36 1 引 言

大田軟海綿酸（OA）及其衍生物鰭藻毒素（DTXs）是一類親脂性聚醚類化合物，主要由鰭藻屬和原甲藻屬有毒甲藻產(chǎn)生\\。當(dāng)有毒微藻被雙殼貝類濾食后，OA和DTXs毒素會在貝類消化腺內(nèi)累積。貝類中沾染的OA和DTXs毒素是導(dǎo)致腹瀉性貝毒中毒（DSP）的主要毒素成分\\。食用染毒貝類后，患者會出現(xiàn)腹瀉、嘔吐等急性中毒癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，OA和DTX1引起成人出現(xiàn)中毒癥狀的最小劑量約為40和36 SymbolmA@

g\\。除上述急性中毒癥狀外，OA和DTXs毒素還是蛋白磷酸酶1（PP1）和蛋白磷酸酶2A（PP2A）的抑制物\\，能夠影響蛋白磷酸化過程，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和腫瘤形成\\。其長期毒性效應(yīng)對貝類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和公眾健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。香港、深圳、舟山、青島、煙臺、天津等地的海產(chǎn)品中曾檢出DSP毒素\\。

對于OA和DTX1等DSP毒素成分，高效液相色譜熒光檢測法（HPLCFLD）和高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析法（HPLCMS）是應(yīng)用最廣的方法\\。HPLCFLD法是通過毒素成分與衍生劑的反應(yīng)，將毒素轉(zhuǎn)化成具有熒光活性的衍生物進(jìn)行檢測。9蒽重氮甲烷（ADAM）和4溴甲基7甲氧基香豆素（BrMmc）等熒光衍生劑常用于OA和DTX1的分析\\。其中，BrMmc衍生法是一種較成熟、在國內(nèi)應(yīng)用較多的DSP毒素分析方法\\。在實(shí)際應(yīng)用中，這些方法都需要有毒素標(biāo)準(zhǔn)品支持。但是，目前毒素標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴，在一定程度上制約著貝類產(chǎn)品質(zhì)量控制工作的開展。本研究組曾從培養(yǎng)的有毒利瑪原甲藻（Prorocentrum lima Dodge）中分離純化了一定量的OA和DTX1毒素（實(shí)驗(yàn)過程另文發(fā)表）。在本研究中，通過HPLCFLD、高效液相色譜紫外檢測法（HPLCUV）、流動(dòng)注射進(jìn)樣質(zhì)譜檢測法和HPLCMS等方法，對制備的OA和DTX1毒素樣品的性質(zhì)和純度進(jìn)行了分析。2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Waters e2695液相色譜系統(tǒng)（美國沃特世公司）； Esquire離子阱質(zhì)譜儀（美國布魯克公司）；Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)（美國安捷倫公司）。

OA和DTX1 毒素樣品（加拿大國家研究院海洋生物科學(xué)研究所）用甲醇溶解，

20 ℃下保存?zhèn)溆?。甲醇、乙腈、丙酮（Merck公司）；甲酸（98%，F(xiàn)luka公司）；4溴甲基7甲氧基香豆素（BrMmc，＞97%），N，N二異丙基乙胺（＞99%）， 購自SigmaAldrich公司。自制超純水。