新型微梁陣列生化傳感器的研制

摘 要 為了消除單微梁生化傳感系統(tǒng)中存在的溫度漂移、溶液折射率變化等環(huán)境噪聲影響，同時(shí)實(shí)現(xiàn)多種靶標(biāo)分子的快速并行檢測(cè)，設(shè)計(jì)制作了新型微梁陣列生化傳感器。利用壓電驅(qū)動(dòng)激光束掃描微梁陣列，并通過光杠桿法實(shí)時(shí)讀出微梁彎曲信號(hào)，即可得到在微梁表面發(fā)生的特異性生化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線。對(duì)250 m間距的兩定點(diǎn)的9 h掃描實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證了系統(tǒng)光路的穩(wěn)定性；同時(shí)進(jìn)行了溫度激勵(lì)測(cè)試，升溫6 ℃后微梁陣列彎曲信號(hào)基本保持一致（誤差6.5%），驗(yàn)證了系統(tǒng)檢測(cè)的可靠性。最后，利用自制毛細(xì)管陣列套合修飾裝置，成功將克倫特羅抗體修飾到微梁陣列一側(cè)的金表面上，對(duì)待測(cè)液中10 g/L克倫特羅標(biāo)樣進(jìn)行了準(zhǔn)確檢測(cè)，驗(yàn)證了此傳感系統(tǒng)在生化檢測(cè)中的實(shí)際可行性。

關(guān)鍵詞 生化傳感器； 無標(biāo)記； 微梁陣列； 壓電驅(qū)動(dòng)； 光杠桿法； 毛細(xì)管陣列

1 引 言

微梁生化傳感技術(shù)是在原子力顯微鏡和微機(jī)電系統(tǒng)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)新興傳感技術(shù)\\，具有檢測(cè)靈敏度高、無需標(biāo)記、能實(shí)時(shí)原位再現(xiàn)生化反應(yīng)信息等優(yōu)點(diǎn)。其檢測(cè)原理是：當(dāng)微梁?jiǎn)蝹?cè)表面上有生化反應(yīng)發(fā)生時(shí)，分子間的相互作用會(huì)導(dǎo)致微梁表面應(yīng)力改變而使微梁產(chǎn)生彎曲，利用光學(xué)或電學(xué)方法檢測(cè)出此變形即可得到該生化反應(yīng)過程信息。經(jīng)過近十年發(fā)展，微梁傳感技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域已從最初的濕度、溫度測(cè)量\\逐漸轉(zhuǎn)變到了生物工程\\、環(huán)境污染監(jiān)測(cè)\\等。自2002年，本研究組以先后利用該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)聚N異丙基丙烯酰胺（PNIPAM）構(gòu)象轉(zhuǎn)變\\、Cu2＋\\、克倫特羅（又稱瘦肉精）和氯霉素\\、紫杉醇\\等的檢測(cè)研究。

為進(jìn)一步消除溫度漂移、溶液折射率變化等環(huán)境噪聲對(duì)單微梁檢測(cè)系統(tǒng)\\的影響，同時(shí)實(shí)現(xiàn)多種靶標(biāo)分子的快速并行檢測(cè)，研發(fā)了微梁陣列傳感技術(shù)。目前，已報(bào)道的微梁陣列傳感研究方法主要有光學(xué)干涉法\\、垂直共振腔面射型激光器（VCSELs）時(shí)序照射檢測(cè)法\\和CCD面光源檢測(cè)法\\等。這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)：光學(xué)干涉法檢測(cè)靈敏度高，但所需檢測(cè)條件過于苛刻，對(duì)系統(tǒng)抗振性能要求極高，在實(shí)際運(yùn)用中很難實(shí)行；VCSELs時(shí)序照射檢測(cè)法能實(shí)現(xiàn)8根微梁的高靈敏檢測(cè)，但由于發(fā)射光束間距不可調(diào)，只能針對(duì)一定間距的微梁陣列進(jìn)行檢測(cè)，靈活性較低，且價(jià)格昂貴；CCD面光源檢測(cè)法能實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，但由于微梁尖端的彎曲會(huì)使圖像產(chǎn)生彌散，嚴(yán)重影響光斑位移的檢測(cè)質(zhì)量，導(dǎo)致其檢測(cè)靈敏度不高。

本研究基于壓電掃描原理提出了微梁陣列生化傳感方法。與已有的檢測(cè)方法相比，本方法具有原理簡(jiǎn)單、靈敏度高、調(diào)節(jié)方便，可以對(duì)任意間距微梁陣列進(jìn)行快速定位檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，研制了毛細(xì)管陣列套合修飾裝置，能有效地將生化分子修飾到微梁陣列上，修飾效率比已有商品化點(diǎn)樣儀更高，且成本更低。利用此裝置成功消除了檢測(cè)環(huán)境中的溫度漂移、溶液折射率變化等噪聲影響，對(duì)待測(cè)液中10 g/L克倫特羅標(biāo)樣進(jìn)行了準(zhǔn)確檢測(cè)。

2 檢測(cè)原理

微梁傳感方法對(duì)生化反應(yīng)的監(jiān)測(cè)過程，實(shí)際上是通過檢測(cè)生化分子在微梁?jiǎn)蝹?cè)表面相互作用時(shí)引起的表面應(yīng)力變化實(shí)現(xiàn)的。根據(jù)Stoney公式\\，微梁端部位移δ與其表面應(yīng)力變化量Δσ之間存在以下關(guān)系：

δ＝3（1－v）l2Et2Δσ（1）

其中，l， t， E和v分別代表微梁的長度、厚度、楊氏模量和泊松比。從式（1）可見，當(dāng)微梁的材料與幾何參數(shù)確定后，δ與σ成正比，檢測(cè)出微梁端部位移即可得到其表面應(yīng)力變化情況，進(jìn)而檢測(cè)出對(duì)應(yīng)的生化反應(yīng)信息。 圖1 微梁陣列檢測(cè)示意圖

Fig．1 Detecting schematic of microcantilever array

目前，對(duì)微梁彎曲變形的檢測(cè)方法主要有電容、壓阻、光學(xué)和電磁檢測(cè)法等\\。其中，光杠桿法由于結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、靈敏度高，在目前使用最普遍，其垂直分辨率可達(dá)1011 m量級(jí)\\。基于該方法，對(duì)微梁陣列上生化反應(yīng)信息進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)的原理圖如圖1所示：在生化反應(yīng)過程中，利用修飾了惰性分子（不參與生化反應(yīng)）的參考梁檢測(cè)環(huán)境噪聲信號(hào)；待反應(yīng)完成后，修飾有探針分子的微梁變形信號(hào)減去參考梁的變形信號(hào)，即得到了僅由探針分子與靶標(biāo)分子特異性結(jié)合產(chǎn)生的微梁變形信號(hào)。

 分 析 化 學(xué)第40卷

第4期鄔 林等： 新型微梁陣列生化傳感器的研制 

3 結(jié)果與討論

3.1系統(tǒng)設(shè)計(jì)

利用壓電掃描原理設(shè)計(jì)制作的微梁陣列生化傳感系統(tǒng)如圖2a所示：利用壓電陶瓷管驅(qū)動(dòng)固定在其上的凸透鏡做周期性往復(fù)運(yùn)動(dòng)，使穿過其中的激光束掃射微梁陣列（圖2b），用PSD靶面時(shí)序接收反射光點(diǎn)位置信號(hào)，即可實(shí)現(xiàn)微梁陣列彎曲變形檢測(cè)，獲得梁上生化反應(yīng)的實(shí)時(shí)信息。

圖2 （a）微梁陣列生化傳感系統(tǒng)示意圖和（b）壓電驅(qū)動(dòng)掃描原理圖

Fig．2 （a） Schematic of microcantilever array biochemical sensor and （b） Schematic of piezodriven scanning

凸透鏡偏轉(zhuǎn)驅(qū)使激光束掃描的原理圖如圖3所示，當(dāng)壓電陶瓷管由于其輸入電壓值變化產(chǎn)生偏轉(zhuǎn)時(shí)，固定在其上的凸透鏡也隨之發(fā)生偏轉(zhuǎn)（中心位置從O點(diǎn)移動(dòng)到O’點(diǎn)），此時(shí)，經(jīng)凸透鏡匯聚后的激光束焦點(diǎn)也相應(yīng)地從F1處移動(dòng)到F2處。通過程序控制輸入電壓的大小和變化周期，即可準(zhǔn)確控制掃描光束的間距和頻率。

圖3 透鏡驅(qū)使激光束掃描原理圖Fig．3 Schematic of laser beam deflecting with lens

圖4 實(shí)驗(yàn)用微梁陣列照片

Fig．4 Photo of microcantilever array used in experiment

3.2 掃描光路穩(wěn)定性測(cè)試

將商品化微梁陣列（德國Micromotive公司，如圖4所示，其中微梁長500 m的兩定點(diǎn)進(jìn)行9 h掃描測(cè)試。結(jié)果表明：在X方向和Y方向上，兩掃描位點(diǎn)位移都保持平穩(wěn)一致，證實(shí)了掃描光路的穩(wěn)定性。

3.3 陣列信號(hào)一致性測(cè)試

調(diào)節(jié)激光束掃描位點(diǎn)，準(zhǔn)確定位微梁1和2尖端，待信號(hào)穩(wěn)定后進(jìn)行溫度激勵(lì)測(cè)試。采用高精度溫控器（精度0.01 ℃）將微梁陣列的環(huán)境溫度從22 ℃逐步升至28 ℃， 圖5 在溫度激勵(lì)下兩微梁的位移曲線圖Fig．5 Displacement of two microcantilevers versus

temperature

所得對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)曲線如圖5所示（圖中將兩梁信號(hào)曲線平移到了原點(diǎn)）。實(shí)驗(yàn)表明，兩微梁的位移響應(yīng)信號(hào)在同一溫度變化激勵(lì)下基本保持一致，在升溫6 ℃后，誤差6.5%（相差量26 nm除以總的變形量400 nm）。由于微梁傳感技術(shù)對(duì)生化反應(yīng)的檢測(cè)主要是針對(duì)分子間的特異性結(jié)合，因此只要能準(zhǔn)確測(cè)出這種特有的反應(yīng)信息，微梁陣列彎曲信號(hào)誤差在10%以內(nèi)是不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的，目前已有的商品化VCSELs型微梁陣列儀（瑞士Concentris公司）檢測(cè)精度也在此量級(jí)，如圖6所示。

為進(jìn)一步測(cè)試陣列系統(tǒng)可靠性，將微梁陣列安放在生化反應(yīng)池中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。模擬實(shí)際生化反應(yīng)環(huán)境，開啟蠕動(dòng)泵使池中溶液流動(dòng)置換，調(diào)節(jié)好掃描光路，在實(shí)驗(yàn)室自然環(huán)境下采集信號(hào)8 h，得到圖7所示信號(hào)曲線。兩根微梁的位移曲線變化趨勢(shì)在隨環(huán)境變化（溫度、溶液流動(dòng)等）過程中始終保持平行，說明在相同的外在激勵(lì)條件下，微梁陣列響應(yīng)信號(hào)一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了系統(tǒng)可靠性。

圖6 VCSEL型微梁陣列儀溫度激勵(lì)數(shù)據(jù)圖Fig．6 Temperature excitation graph of VCSELs

microcantilever array sensor

圖7 在自然環(huán)境下兩微梁的位移曲線圖Fig．7 Displacement curves of two microcantilevers in the natural environment

3.4 特異性生化反應(yīng)檢測(cè)

3.4.1 實(shí)驗(yàn)試劑 克倫特羅抗體，克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)樣品（CLEN），氯霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品（CAP）均取自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院；活化劑： 1Ethyl3（3dimethyl aminopropyl） carbodiimide （EDC），NHydroxysulfosuccinimide （NHS）；硫醇 HSCH2COOH （Sigma公司）；PBS （4.0 g NaCl＋0.1g KH2PO4＋1.48 g Na2HPO4·H2O＋500 mL去離子水）；TPBS （PBS＋0. 5% Tween20）；98%濃H2SO4；30% H2O2，均為分析純。

3.4.2 微梁陣列上抗體的修飾 將微梁陣列浸入H2O2H2SO4（1∶3， V/V）混合溶液中10 min（室溫），洗去雜質(zhì)，取出用去離子水沖洗后放入孔板中，加入200 L 0.1 mol/L硫醇后，封口靜置20 h（室溫），利用硫醇自帶的巰基（HS）自組裝到微梁陣列一側(cè)的鍍金表面上。反應(yīng)完成后，取出微梁陣列，依次用乙醇和去離子水沖洗，放入新孔板中，注入100 g/L CLEN標(biāo)樣，此時(shí)修飾有克倫特羅抗體的梁1響應(yīng)信號(hào)明顯大于未修飾克倫特羅抗體的梁2響應(yīng)信號(hào)，說明：梁1上發(fā)生了克倫特羅抗原抗體特異性結(jié)合，導(dǎo)致了其表面應(yīng)力的顯著變化；梁2的響應(yīng)信號(hào)幅度較小，可能是由環(huán)境擾動(dòng)引起。將梁1與梁2（參考梁）響應(yīng)信號(hào)之差，即為僅由克倫特羅抗原抗體特異性結(jié)合產(chǎn)生的真實(shí)微梁變形信號(hào)（38 nm）。

圖8 利用毛細(xì)管修飾CLEN抗體到微梁陣列上照片

Fig．8 Photo of immobilizing clenbuterol （CLEN） antibody on microcantilever array with capillary

圖9 微梁陣列對(duì)CLEN抗原抗體特異性結(jié)合的檢測(cè)

Fig．9 Detection of CLEN antigenantibody specific binding with microcantilever array

微梁生化檢測(cè)過程中，抗原抗體結(jié)合導(dǎo)致微梁上表面應(yīng)力變化的機(jī)理， 目前認(rèn)為主要是由親疏水作用、靜電力和氫鍵等導(dǎo)致\\。對(duì)于本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)用的CLEN而言， 認(rèn)為主要是由靜電排斥力導(dǎo)致。根據(jù)公式（1），帶入相關(guān)參數(shù)，計(jì)算可得10

g/L CLEN標(biāo)樣與梁上修飾的CLEN抗體發(fā)生特異性結(jié)合后，導(dǎo)致了微梁上約0.0184 N/m的表面應(yīng)力變化。



References

1 Singamaneni S， LeMieux M C， Lang H P， Gerber C， Lam Y， Zauscher S， Datskos P G， Lavrik N V， Jiang H， Naik R R， Bunning T J， Tsukruk V V. Adv. Mater.， 2008， 20（4）: 653～680

2 XU YingMing， PAN HongQing， WU SanHua， ZHANG BaiLin. Chinese J. Anal. Chem.， 2009， 37(6): 783～787

徐英明， 潘宏青， 伍三華， 張柏林. 分析化學(xué)， 2009， 37(6): 783～787

3 Thundat T， Warmack R J， Chen G Y， Allison D P. Appl. Phys. Lett.， 1994， 64（21）: 2894～2896

4 Zhang J， Lang H P， Huber F， Bietsch A， Grange W， Certa U， McKendry R， Guntgerodt H J， Hegner M， Gerber C. Nat. Nanotechnol.， 2006， 1（3）: 214～220

5 Drelich J， White C L， Xu Z H. Environ. Sci. Technol.， 2008， 42（6）: 2072～2078

6 LI Kai， LIU Hong， ZHANG QingChuan， HOU Yi， ZHANG GuangZhao， WU XiaoPing. Acta Phys. Sin.， 2006， 55（8）: 4111～4116

李 凱， 劉 紅， 張青川， 侯 毅， 張廣照， 伍小平. 物理學(xué)報(bào)， 2006， 55（8）: 4111～4116

7 Zhao H W， Xue C G， Nan T G， Tan G Y， Li Z H， Li Q X， Zhang Q C， Wang B M. Anal. Chim. Acta， 2010， 676（12）: 81～86

8 Tan W M， Huang Y， Nan T G， Xue C G， Li Z H， Zhang Q C Wang B M. Anal. Chem.， 2010， 82（2）: 615～620

9 XUE ChangGuo， ZHAO HongWei， WU ShangQuan， NAN TieGui， WANG BaoMin， ZHANG QingChuan， WU XiaoPing. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（6）: 863～866

薛長國， 趙洪偉， 吳尚犬， 南鐵貴， 王保民， 張青川， 伍小平. 分析化學(xué)， 2011， 39（6）: 863～866

10 Huang Y， Liu H， Li K， Chen Y Y， Zhang Q C， Wu X P. Sens. Actuators A， 2008， 148（1）: 329～334

11 Reed J， Schmit J， Han S， Wilkinson P， Gimzewski J K. Opt. Laser Eng.， 2009， 47（2）: 217～222

12 Zhang R， Best A， Berger R， Cherian S， Lorenzoni S， Macis E， Raiteri R， Cain R. Rev. Sci. Instrum.， 2007， 78（8）: 1～7

13 Yue M， Stachowiak J C， Lin H， Datar R，Cote R， Majumdar A. Nano Lett.， 2008， 8（2）: 520～524

14 Stoney G G. Proceedings of the Royal Society of London Series A， 1909， 82（553）: 172～175

15 Hu Z Y， Seeley T， Kossek S， Thundat T. Rev. Sci. Instrum.， 2004， 75（2）: 400～404

16 van Oss C J. Mol. Immunol.， 1995， 32（3）: 199～211



A Novel Microcantilever Array Biochemical Sensor



WU Lin1， ZHOU XiaRong1， WU ShangQuan1， WANG Ping2， ZHANG QingChuan*1， WU XiaoPing1

1（Key Laboratory of Mechanical Behavior and Design of Material of Chinese Academy of Sciences，

University of Science and Technology of China， Hefei 230027， China）

2（Laboratory of Physical Biology， Shanghai Institute of Applied Physics，Chinese Academy of Sciences， Shanghai 201800， China）



Abstract To eliminate the impact of environmental noise such as temperature drift and change ofliquid refractive index in the single microcantilever biochemical sensing system and achieve rapid parallel detection of a variety of target molecules， a novel microcantilever array biochemical sensor was designed and manufactured. When the microcantilever array was scanned by a piezoelectricdriven laser beam， the kinetic curves of the specific biochemical reaction on the microcantilever array surface was obtained by realtime monitoring the deflections of the microcantilevers with the optical lever readout technique. In the experiment， the system optical stability was verified by 9 h scanning of two fixed points with 250