大豆Em(LEA1)蛋白保守結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和聚集特性

摘 要 采用圓二色譜（CD）和核磁共振波譜（NMR）方法研究了大豆Em（LEA1）蛋白保守基序EmC和Em2M多肽在不同環(huán)境中的結(jié)構(gòu)及聚集行為。研究表明，在水和DMPG溶液中，兩種多肽主要以無(wú)規(guī)結(jié)構(gòu)形式存在。在50% TFE 溶液中，EmC多肽折疊結(jié)構(gòu)增加，含疏水殘基的部分區(qū)域可能形成α螺旋結(jié)構(gòu)，且分子以二聚體形式存在；而Em2M則以單體形式存在，且有序結(jié)構(gòu)較少。以上結(jié)果表明，環(huán)境變化可能導(dǎo)致兩種多肽的空間結(jié)構(gòu)和聚集行為改變，這有助于理解Em蛋白在不同環(huán)境中的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，及其重要區(qū)域在全長(zhǎng)蛋白中所起的作用。

關(guān)鍵詞 晚期胚胎發(fā)生富集（LEA1）蛋白； 核磁共振； 結(jié)構(gòu)； 聚集

1 引 言

晚期胚胎發(fā)生富集（Late embryogenesis abundant，LEA）蛋白是一類與植物抗逆反應(yīng)相關(guān)的重要蛋白質(zhì)。根據(jù)其表達(dá)模式和序列特點(diǎn)，可將其分為7組\\。其中第一組LEA蛋白（簡(jiǎn)稱為L(zhǎng)EA1）全長(zhǎng)序列高度保守，富含甘氨酸和帶電氨基酸，且在氨基端、中部和羧基端分別存在不同20氨基酸基序\\。LEA1蛋白主要存在于植物界中，在一些細(xì)菌和甲殼綱動(dòng)物，如豐年蝦等生物體中也發(fā)現(xiàn)了此類蛋白\\。已有研究表明，小麥PM1959、大豆Em和小麥TaEm蛋白（LEA1）的表達(dá)可以提高多種生物（如轉(zhuǎn)基因植物、酵母和大腸桿菌重組子）對(duì)干旱、高鹽和滲透等脅迫的耐受性\\。體外實(shí)驗(yàn)證明，小麥Em和大豆Em等（LEA1）可保護(hù)乳酸脫氫酶（LDH）或檸檬酸合成酶免于因高溫、干燥和冰凍脅迫所引起的酶活性喪失\\，LEA1蛋白可能具有多重保護(hù)功能。因此，揭示LEA1蛋白的保護(hù)功能，理解其作用機(jī)理，可為有效利用LEA基因，培育抗逆植物新品種提供重要的基礎(chǔ)資料。

在天然狀態(tài)下，LEA蛋白為無(wú)規(guī)結(jié)構(gòu)蛋白\\。Tunnacliffe等\\指出，LEA蛋白結(jié)構(gòu)的可塑性可能是實(shí)現(xiàn)多功能的重要基礎(chǔ)。在水溶液中， LEA1蛋白多以自由卷曲和少量α螺旋結(jié)構(gòu)存在。當(dāng)遇干燥脅迫或在醇溶液中，LEA1蛋白的α螺旋含量增多，預(yù)示著LEA1蛋白的α螺旋結(jié)構(gòu)將參與對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用\\。小麥Em蛋白（LEA1）N端的α螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)經(jīng)干燥脅迫的酶活性的保護(hù)作用是必需的\\。因此，研究LEA1蛋白和其重要結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)及其隨環(huán)境的變化，有助于揭示在各種環(huán)境脅迫下LEA1蛋白與其它分子間可能發(fā)生的相互作用，及保護(hù)生物大分子等過(guò)程。

大豆Em蛋白屬LEA1蛋白，可編碼105個(gè)氨基酸，其中的第44～63位氨基酸為保守的中部20氨基酸基序（EmM區(qū)），該基序前面有43個(gè)氨基酸片段（EmN區(qū)），基序后面有42個(gè)氨基酸片段（EmC區(qū)）。本課題組最近報(bào)告，大豆Em蛋白全長(zhǎng)蛋白、EmC、Em2M（含2個(gè)M區(qū)）和EmN片段的表達(dá)均可賦予重組大腸桿菌對(duì)高鹽的耐受性，而且還可以通過(guò)穩(wěn)定LDH酶蛋白結(jié)構(gòu)、阻止其聚集而保護(hù)凍融脅迫下的LDH酶活性\\。

為了認(rèn)識(shí)Em蛋白和其保守結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，及其隨環(huán)境變化的特點(diǎn)，并為進(jìn)一步理解其重要區(qū)域在全長(zhǎng)蛋白中所起的作用提供有用的結(jié)構(gòu)信息，本研究采用圓二色譜（CD）和核磁共振波譜（NMR）方法研究了EmC和Em2M多肽在水、50% TFE溶液和陰性脂質(zhì)體（DMPG）等不同環(huán)境下的結(jié)構(gòu)和聚集行為。2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 材料

多肽EmC和Em2M（表1）的表達(dá)、純化及鑒定參見(jiàn)文獻(xiàn) \\。氘代三氟乙醇（TFEd2；98%，Cambridge Isotope Laboratories公司）；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油（DMPG，Avanti Polar Lipids Inc公司）；氯仿和甲醇（東莞市東江化學(xué)試劑有限公司）。

表1 多肽氨基酸序列（50個(gè)氨基酸）

Table 1 Sequence of peptides （50 amino acid）

M domain of soybean LEAI protein Em （Em2M）GSHMASGGQTRKEQLGTEGYQEMGRKTSGGQTRKEQLGTEGYQEMGRKTSC domain of soybean LEAI protein Em （EmC）GSHMASGGLSTVDKSGEERAQEEGIGIDESKFRTGNNKNQNQNEDQDKTS

2.2 分析方法

2.2.1 遠(yuǎn)紫外圓二色譜（FarUV CD） （1）樣品制備 A. 水溶液中樣品：將適量肽直接溶于20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）中，使肽的終濃度為7

mol/L，磷脂與肽的濃度比為100∶1，混合溶液在35 ℃水浴中超聲1 h。（2） 儀器 Jasco J815圓二色譜儀。石英比色皿光程為0.1 cm，波長(zhǎng)范圍190～250 nm；帶寬1.0 nm；所有實(shí)驗(yàn)均在20 ℃進(jìn)行。每個(gè)樣品掃描2次，每張譜圖取2次的平均值。所有肽膜體系的譜圖均為經(jīng)過(guò)扣除單獨(dú)的磷脂膜（背底）后的結(jié)果，以平均殘基摩爾橢偏率θ表示：

θ＝θobs10lcn（1）

θobs是實(shí)驗(yàn)所測(cè)的橢偏率（mdeg），l是石英比色皿的路徑長(zhǎng)度（cm），c是肽的濃度（mol/L），n是多肽所含氨基酸個(gè)數(shù)。

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是通過(guò)CDPro軟件進(jìn)行分析得到的。軟件由3個(gè)常用的程序SELCON3， CDSSTR和CONTIN組成。以48個(gè)參考蛋白對(duì)CD譜進(jìn)行分析，并取3種程序計(jì)算結(jié)果的平均值。

2.2.2 核磁共振波譜 樣品制備：將適量的EmC和Em2M多肽分別溶于50% TFEd2溶液，使多肽的終濃度為2.88 mmol/L。

用于結(jié)構(gòu)測(cè)定的核磁實(shí)驗(yàn)均在布魯克AVANCE 600 MHz核磁共振波譜儀上完成，探頭為配備了X， Y， Z梯度線圈的5 mm三共振反式探頭。選用TSPd4作為內(nèi)標(biāo)。實(shí)驗(yàn)溫度為298 K，所有二維1H譜均采用了壓水峰技術(shù)。TOCSY和NOESY實(shí)驗(yàn)采用儀器自帶的標(biāo)準(zhǔn)脈沖序列進(jìn)行采樣，混合時(shí)間分別為100和200 ms。采樣數(shù)據(jù)矩陣2048

512，累加96～168次。采用標(biāo)準(zhǔn)Bruker軟件（XWINNMR 3.5版本）進(jìn)行譜圖處理，處理后的譜圖用SPARKY軟件進(jìn)行分析。

 

擴(kuò)散排序（DOSY）核磁共振實(shí)驗(yàn)在配備有Z軸梯度場(chǎng)的三共振反向檢測(cè)探頭的布魯克AVANCE 500MHz核磁共振波譜儀上完成，實(shí)驗(yàn)溫度為298 K。肽擴(kuò)散系數(shù)的測(cè)定采用了含有WATERGATE壓水峰技術(shù)的BPPSTE（Bipolar Pulse Pair Stimulated Echo）脈沖序列。水或TFE擴(kuò)散系數(shù)的測(cè)定采用不含壓水峰技術(shù)的STE（Stimulated Echo）脈沖序列。