離子色譜法測(cè)定大腸癌患者尿液中的甘露醇和乳果糖

摘 要 建立了大腸癌患者尿液中甘露醇和乳果糖的高效陰離子交換分離脈沖積分安培（HPAECPAD）檢測(cè)方法。樣品經(jīng)稀釋、凈化、過(guò)濾后進(jìn)行色譜分析， 采用Carbopac PA1（250 mm×4 mm）陰離子交換柱分離， 以NaOH乙酸鈉梯度淋洗液為流動(dòng)相， 流速1.0 mL/min， 脈沖積分安培檢測(cè)器（PAD）檢測(cè)， 外標(biāo)法定量。結(jié)果表明， 甘露醇和乳果糖的的線(xiàn)性范圍為0.2～20 mg/L， 相關(guān)系數(shù)分別為0.9995和0.9998， 回收率為91.7%～102.6%， 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.1%， 檢出限為0.05和0.06 mg/L（S/N＝3）。本方法前處理簡(jiǎn)便、靈敏度高、重現(xiàn)性好， 可用于大腸癌患者尿液中的甘露醇和乳果糖的測(cè)定。

關(guān)鍵詞 離子交換色譜； 甘露醇； 乳果糖； 尿液

1 引 言

乳果糖和甘露醇均為不被人體代謝的糖類(lèi)， 在正常情況下， 不易被腸道吸收， 在尿中含量很少。在病理情況下， 腸粘膜受損， 細(xì)胞間的緊密連接被破壞， 細(xì)胞間隙擴(kuò)大， 通透性增加， 通過(guò)細(xì)胞旁通道吸收的乳果糖（Latulose， L）量明顯增加。而穿過(guò)小腸上皮細(xì)胞水溶性微孔吸收的甘露醇（Mannitol， M）的吸收量變化甚微， L與M的比值L/M增大。L/M可排除胃排空時(shí)間、心輸出量、腎排出量及尿液收集等誤差對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響， 能真實(shí)地反映腸粘膜屏障通透性變化情況。腸通透性是評(píng)價(jià)腸屏障功能的重要指標(biāo)。

高效陰離子交換脈沖積分安培分離檢測(cè)方法（HPAECIPAD）目前已被廣泛應(yīng)用于各種糖的分析測(cè)定。本方法主要依據(jù)糖類(lèi)在堿性溶液中可呈現(xiàn)離子化狀態(tài)， 不同糖類(lèi)的離子化程度不同， 即pKa不同， 根據(jù)糖類(lèi)pKa的差異以及某些糖類(lèi)與陰離子交換樹(shù)脂之間的疏水性相互作用而在離子交換色譜柱上實(shí)現(xiàn)分離。同時(shí)， 糖類(lèi)的羥基在堿性溶液中具有電化學(xué)活性， 在外加電壓作用下， 羥基易在金電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)， 根據(jù)羥基在金電極表面發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生的電量大小實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。該方法具有無(wú)需衍生、操作方便、靈敏度高、不使用有毒化學(xué)試劑和有機(jī)溶劑的優(yōu)點(diǎn)， 對(duì)糖類(lèi)的檢出限可以達(dá)到pmol級(jí)\\。

目前， 尿液中甘露醇和乳果糖的測(cè)定主要采用氣相色譜法\\及高壓液相色譜儀\\， 常用檢測(cè)器是ELSD、MS和 RID， 但它們都存在前處理繁瑣、操作復(fù)雜或重復(fù)性不佳等缺點(diǎn)， 特別是靈敏度低， 達(dá)不到檢測(cè)要求， 且容易受到復(fù)雜基體的干擾。

離子色譜安培檢測(cè)分離度好、靈敏度高， 比UVELSD和UVRID法優(yōu)勢(shì)明顯。于博昊等\\采用離子色譜的方法曾對(duì)幼兔尿樣中的甘露醇和乳果糖進(jìn)行定性與定量檢測(cè)， 結(jié)果表明， 離子色譜法能有效檢測(cè)甘露醇和乳果糖， 且方便快捷， 具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。馮蕾等\\建立了固相萃取高效陰離子交換色譜積分脈沖安培法測(cè)定癌癥患者尿液中異黃蝶呤的分析方法， 能去除大量干擾物質(zhì)， 具有靈敏度高、選擇性好、對(duì)環(huán)境造成的二次污染小等特點(diǎn)。

本研究采用高效陰離子交換脈沖積分安培法分離人體尿液中甘露醇和乳果糖， 并應(yīng)用于大腸癌患者尿液的實(shí)際樣品測(cè)試。

20 ℃的冰箱保存。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱(chēng)取標(biāo)樣， 用含20 mg/L NaN3超純水制1000 mg/L的甘露醇和乳果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液， 保存于冰箱冷藏室中。臨用時(shí)稀釋成100 mg/L， 分別準(zhǔn)確移取適量的100 mg/L甘露醇和乳果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 mL容量瓶中， 用水定容， 配制成0， 0.2， 0.5， 1.0， 2.0， 5.0， 10.0和20.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

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2.2.3 供試溶液的配制 抽取尿液樣品， 以10000 r/min離心10 min， 分別準(zhǔn)確移取上清液1.0 mL， 置于100 mL容量瓶中， 以水定容。