適配體生物傳感器在病原微生物檢測中的應用

摘 要 適配體是通過指數(shù)富集系統(tǒng)進化技術（SELEX）體外篩選得到的一類能夠特異性地結(jié)合小分子物質(zhì)、蛋白， 甚至整個細胞的寡核苷酸序列。由于具有制備簡便、易于修飾、穩(wěn)定性好等特點， 適配體已廣泛應用于構(gòu)建生物傳感器， 實現(xiàn)對病原微生物的識別和檢測。本文在闡述適配體基本原理的基礎之上， 結(jié)合近年來病原微生物適配體研究領域的最新研究成果， 綜述以病原微生物為目標的適配體篩選技術的最新進展；列舉目前已經(jīng)篩選獲得的病原微生物（原生生物、病毒、細菌）適配體；綜述適配體生物傳感器在病原微生物檢測中的應用。并展望了適配體生物傳感器在病原微生物檢測領域的發(fā)展趨勢。

關鍵詞 適配體； 病原微生物； 檢測； 生物傳感器； 評述

1 引 言

病原微生物是一類引起人類與動植物各種疾病的微生物， 包括原生生物、病毒和細菌。常見的病原微生物有瘧原蟲、人類免疫缺陷病毒、大腸埃希氏桿菌、傷寒沙門氏菌等。每年它們給人類和各種動植物的健康造成了極大的危害， 帶來了巨大的經(jīng)濟損失\\。因此， 迫切需要研發(fā)快速、靈敏和低成本的檢測方法， 以監(jiān)測和控制它們在食品和環(huán)境中的傳播。傳統(tǒng)的病原微生物檢測方法首先通過分離培養(yǎng)， 然后進行一系列復雜繁瑣的生化測試檢測樣品中的微生物\\。這種檢測方式雖然具有很高的靈敏度和特異性， 但是需要的時間較長（通常需要5～7 d）， 因而不適用于快速現(xiàn)場檢測。近年來， 生物傳感器由于具有快速、靈敏、特異性高、成本低的優(yōu)點， 而被廣泛運用于病原微生物的檢測\\。生物傳感器是利用分子識別元件和待測病原微生物的特異性結(jié)合產(chǎn)生的生物學信息， 通過轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)化為電、光等物理信號輸出， 從而達到分析檢測的目的\\。常見的分子識別元件為抗體， 抗體具有高親和性、高特異性， 基于抗體的生物傳感器目前已被廣泛的研發(fā)。但是抗體具有一些自身的局限性， 如針對某種目標物的抗體需要一系列繁瑣復雜的體內(nèi)篩選過程， 因而實驗周期長， 成本高， 同時抗體容易變性， 對檢測環(huán)境的要求較高\\。因此， 需要研發(fā)一種新的分子識別元件， 不僅具有抗體的高特異性， 同時又能克服抗體存在的缺點， 應用于病原微生物檢測。

適配體是一類在體外篩選的， 能與相應目標物專一并緊密結(jié)合的一類單鏈寡核苷酸序列\\。在生物傳感器的構(gòu)建方面， 適配體具有一些優(yōu)于抗體的優(yōu)點：（1）適配體是通過體外篩選， 適配體SELEX篩選周期一般為2～3個月， 最快的只需2周， 而制備單克隆抗體則至少需要3～6個月， 且成本昂貴；（2）適配體是通過化學法合成的， 因而可以在適配體上靈活修飾多種基團， 使其具有多種功能；（3）抗體的蛋白本質(zhì)決定了它容易變性， 傳統(tǒng)免疫生物傳感器化學和物理性質(zhì)的不穩(wěn)定限制了生物傳感器的應用范圍， 而適配體具有化學穩(wěn)定性， 在pH 2～12的寬范圍內(nèi)保持穩(wěn)定， 并具有一定的熱復性；（4）適配體組成簡單， 一般由幾十個核苷酸（少于100 nt）組成， 因而適配體的設計相對簡單。由于適配體擁有抗體無法比擬的優(yōu)勢， 利用適配體設計生物傳感器對病原微生物進行識別和檢測， 具有極其重要的意義\\。

2 病原微生物核酸適配體的SELEX篩選方法

SELEX技術是篩選特異性適配體的通用過程， 主要有5步（圖1）：結(jié)合、分離、洗脫、擴增和調(diào)節(jié)。首先將包含有1013～1015個隨機序列的核苷酸序列庫（ssDNA文庫、RNA文庫）與靶分子混合溫育， 隨后通過物理方法分離出結(jié)合了靶分子的核苷酸序列。洗脫收集獲得結(jié)合序列， 并將結(jié)合序列進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增生成次級文庫， 用于下輪篩選。一般通過6～20輪SELEX循環(huán)， 對已達到高親和力的擴增產(chǎn)物進行克隆測序， 從而獲得特異性識別靶分子的適配體\\。對于篩選病原微生物適配體的SELEX過程， 最關鍵的兩個步驟為篩選適配體靶分子的選擇和結(jié)合序列的分離。

圖1 SELEX 技術流程圖\\

Fig．1 Schematic of systematic evolution of exponential enrichment （SELEX） technique\\

2.1 篩選適配體的靶分子

病原微生物為生物大分子， 具有復雜的靶結(jié)構(gòu)。篩選適配體的靶分子常為病原微生物細胞表面某個特定純化蛋白\\、病原微生物細胞的裂解物\\或者是完整的細胞\\。

目前， 大部分適配體的篩選是選擇純化的可溶性蛋白作為靶分子。這是因為純化的蛋白成分單一， 能夠保證每個循環(huán)中與核酸結(jié)合的蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性， 提高SELEX篩選的效率\\。但是， 使用純化蛋白作為靶分子也存在一些缺點。首先， 被篩選的純化蛋白分子不能保持其在完整細胞中的天然構(gòu)象， 從而引起篩選出來的適配體與完整細胞的結(jié)合力減弱；其次， 有些純的靶蛋白不易獲得， 特別是當篩選的目標物未知時， 以純化的某種特定蛋白作為靶分子篩選適配體會更加困難。

研究構(gòu)成復雜的病原微生物需要一種針對復合靶的篩選方法。微生物適配體篩選多采用完整的細胞作為復合靶分子， 但這種復合靶分子通常會帶來靶分子位點多、不易篩選出高特異性核酸適配體的問題。為了解決該問題， 通常使用兩種或多種同源微生物， 用于反向、消減篩選步驟， 以得到針對目標微生物的具有高特異性的適配體\\。Cao等以完整的金黃色葡萄球菌作為靶分子進行篩選， 為了提高篩選適配體的特異性， 而使用鏈球菌和表皮葡萄球菌進行消減篩選。經(jīng)過多輪篩選， 得到11條對金黃色葡萄球菌具有特異性的適配體， 并且證明多條適配體聯(lián)合使用比單一的適配體對金黃色葡萄球菌的特異性更高\\。

2.2 結(jié)合序列的分離

有效去除未結(jié)合的寡核苷酸是適配體篩選過程中的關鍵步驟之一， 對篩選適配體的結(jié)合特性有極大影響。良好的分離方法可以有效減少篩選的循環(huán)次數(shù)， 提高篩選適配體的特異性和親和性。由于靶分子為蛋白或完整細胞， 屬于生物大分子， 常用的分離結(jié)合序列的方法有過濾法\\、離心法\\、磁珠分離法。以上幾種方法雖然可以將病原微生物結(jié)合復合物與未結(jié)合核苷酸序列分離， 但是分離的同時不能得到病原微生物與核苷酸序列的親和信息， 而需要后續(xù)繁瑣的測試過程。目前， 一些新的分離技術， 如毛細管電泳技術\\、表面等離子共振\\、流式細胞術等， 已逐步用于分離病原微生物結(jié)合復合物與未結(jié)合核苷酸序列， 這些方法在實現(xiàn)分離的同時還可以評估微生物與核酸序列的親和性， 使得適配體的篩選過程變得相對簡便。毛細管電泳的原理是基于不同組分間荷質(zhì)比差異導致的電泳遷移率不同而進行分離。當靶分子與其適配體親和作用足夠強， 形成的復合物足夠穩(wěn)定時， 在合適的分離和檢測條件下， 可分別得到游離的寡核苷酸與復合物的電泳峰\\。毛細管電泳技術具有分離速度快、分辨率高、操作簡單、樣品用量少和研究成本低等明顯優(yōu)勢， 在這個領域已顯示出巨大的潛力。此外， 表面等離子共振、流式細胞術等近年來在適配體的篩選分離中也有所應用。這些方法不僅能高效分離結(jié)合序列， 更能同時測定篩選出的核苷酸與靶分子的親和能力， 簡化了SELEX的步驟， 在適配體篩選領域具有十分重要的意義。

3 病原微生物的適配體

3.1 原生生物適配體

錐蟲是一類重要的病原微生物， 它可寄生在多種溫血動物和冷血動物中， 給人類和動物的健康造成了極大的危害。最早篩選出的錐蟲適配體是布氏錐蟲適配體。Homann等\\使用布氏錐蟲的完整細胞作為目標靶分子， 篩選出3類共22條不同序列的RNA適配體， 能特異性地識別布氏錐蟲細胞表面的鞭毛蛋白。隨后， Ulrich等\\又篩選出另一種錐蟲——克氏錐蟲的適配體， 獲得4類共23條RNA適配體， 該適配體能特異地與克氏錐蟲表面識別宿主細胞的位點結(jié)合。

3.2 病毒適配體

目前， 篩選獲得的病毒適配體主要的是人類免疫缺陷病毒（HIV）\\、肝炎病毒\\、流感病毒\\、非典型性肺炎病毒（SARS）\\的適配體（表1）。人類免疫缺陷病毒屬于慢病毒屬， 是一種潛伏期極長的逆轉(zhuǎn)錄病毒。針對HIV表面的不同蛋白， 包括結(jié)構(gòu)蛋白RT（p50逆轉(zhuǎn)錄酶）\\、結(jié)構(gòu)蛋白gp120\\、調(diào)控蛋白Tat\\， 分別篩選出3種可以與HIV特異并高親和性結(jié)合的適配體。而肝炎病毒是適配體篩選的另一大類病毒， 它是引起病毒性肝炎的病原體。Fukuda和Biroccio分別以丙肝病毒（HCV）的非結(jié)構(gòu)蛋白NS3\\和NS5\\為靶分子， 篩選出針對HCV的適配體。流感病毒是一類容易大范圍流行的病毒。