S,S-氰戊菊酯間接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法研究

摘 要 合成了S，S氰戊菊酯的半抗原S2（4氯苯基）3甲基丁酸αS（N丁酸基）甲酰氨（3苯氧基）芐酯（Efvb）。半抗原通過混合酸酐法與卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)作為包被抗原，活潑酯法與牛血清蛋白（BSA）偶聯(lián)作為免疫抗原。用免疫抗原免疫新西蘭大白兔，得到抗S，S氰戊菊酯多克隆抗體。通過異源分析及檢測條件優(yōu)化，確立了間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法的最佳檢測條件為pH 7.4， 0.4 mol/L Na＋、40%甲醇PBS溶液，建立了S，S氰戊菊酯酶聯(lián)免疫分析方法。方法的抑制中濃度（IC50）值為（3.16±0.01）mg/L；檢出限（IC10）為（0.0053±0.0012） mg/L。對甲氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯及其代謝物戊菊酸沒有明顯交叉反應(yīng)。在自來水、河水和土壤樣品中添加S，S氰戊菊酯，其回收率分別為82.3%～108.2%， 83.1%～109.2%和72.0%～91.2%。

關(guān)鍵詞 S，S氰戊菊酯；半抗原；酶聯(lián)免疫吸附分析

1 引 言

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S，S氰戊菊酯（Esfenvalerate）是氰戊菊酯的4種立體異構(gòu)體中活性最高的一種\\，生物活性約為氰戊菊酯的4倍\\。S，S氰戊菊酯對哺乳動物低毒，但對水生生物高毒\\，其廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，進入水環(huán)境的途徑也日益增多。因此，建立簡單快速的檢測方法非常必要。我國對S，S氰戊菊酯的殘留檢測以氣相色譜法為主\\，此方法需要精密儀器，不適合大批量樣品的快速測定。酶聯(lián)免疫分析方法成本低、速度快，適合大批量樣品的快速分析，可為S，S氰戊菊酯的殘留檢測和監(jiān)控提供極大的便利。

目前，對立體異構(gòu)體的免疫分析研究很少，Shan等\\將3\\丙酸芐酯與S戊菊酸聯(lián)接，通過酯水解制得半抗原。此方法保留了菊酸部分的一個手性位點，所得的抗體對S，S氰戊菊酯有較高靈敏度。本研究用S，S氰戊菊酯直接水解接臂，制得半抗原，保留了S，S氰戊菊酯的兩個手性位點，通過免疫新西蘭大白兔獲得特異性抗體，經(jīng)過異源分析及檢測條件優(yōu)化，建立了S，S氰戊菊酯酶聯(lián)免疫分析方法。此抗體對S，S氰戊菊酯立體識別特異性強。在自來水、河水和土壤樣品中添加回收率和相對標準偏差均符合農(nóng)藥殘留分析要求，可用于水樣和土壤樣品中S，S氰戊菊酯的測定。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

HT5多功能攪拌器（江蘇榮華儀器有限公司）；R200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BüCHI公司）；DU800核酸/蛋白分析儀（美國Beckman公司）； LCMSQDECA液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Finnigan公司）；DRX 500 核磁共振儀（美國Bruker公司）；Avanti J26XP高速冷凍離心機（美國Beckman公司）；Professional Meter PP50型pH計（德國Sartorius公司）；Wellwash Plus型洗板機（美國Thermo公司）；iMark酶標儀（美國BioRad公司）。

S，S氰戊菊酯（江蘇皇馬農(nóng)化有限公司）；氰戊菊酯（南京紅太陽股份有限公司）；S戊菊酸及R戊菊酸（江蘇科達化工有限公司）；4氨基丁酸（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；牛血清蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA，上海索萊寶生物科技有限公司）；山羊抗兔IgGHRP（美國Sigma公司）；鄰苯二胺（OPD）及吐溫20（Tween20）（Sigma公司），其它試劑為分析純。半抗原甲氰菊酯氰基水解產(chǎn)物（Fpa）、溴氰菊酯氰基水解產(chǎn)物（Dta）和三氟氯氰菊酯氰基水解產(chǎn)物（Cya），合成方法參考文獻\\。磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.4）、碳酸鹽緩沖液（CBS，0.05 mol/L，pH 9.6）、含0.05%吐溫20的PBS溶液（PBST）。實驗動物：雄性新西蘭大白兔。

2.2 實驗方法

2.2.1 半抗原的合成 合成路線如圖解1所示。取5.9 g （14 mmol） S，S氰戊菊酯和3 mL水于150 mL三口瓶中，緩慢滴加8 mL 濃 H2SO4，于90 ℃回流攪拌反應(yīng)50 min。加入10 mL水，用乙醚萃取兩次，有機相減壓濃縮，得深黃色油狀物。薄層層析純化，展開劑為乙酸乙酯石油醚乙酸（30∶70∶5，V/V），Rf＝0.51的組分用丙酮洗脫濃縮，得黃色的油狀物S2（4氯苯基）3甲基丁酸αS羧基3苯氧基芐酯（Efva），產(chǎn)率約為30%。

稱取2.0 g（4.5 mmol）Efva于100 mL三口燒瓶中，加入5 mL氯化亞砜，在79 ℃回流攪拌反應(yīng)2.5 h。減壓濃縮，得黃色油狀液體，加入15 mL無水四氫呋喃溶解，于4 ℃下貯存?zhèn)溆谩＊?/p>

稱取0.3 g（2.98 mmol）4氨基丁酸于100 mL平底燒瓶中，加入2 mL 2 mo1/L NaOH溶液，在冰浴中攪拌20 min后，加入0.02 g四丁基溴化銨。攪拌下滴加酰氯的四氫呋喃溶液，同時測定體系pH值，滴加NaOH溶液保證反應(yīng)液pH＞8。在冰浴中繼續(xù)攪拌反應(yīng)4 h。用濃HCl調(diào)至pH 2.0，2×30 mL乙酸乙酯萃取，2×10 mL水洗，無水Na2SO4干燥，減壓濃縮，得到黃色的油狀物。薄層層析純化。展開劑為乙酸乙酯石油醚乙酸（28∶67∶5， V/V），Rf＝0.36組分用丙酮洗脫濃縮，得黃色油狀產(chǎn)物S2（4氯苯基）3甲基丁酸αS（N丁酸基）甲酰氨（3苯氧基）芐酯（Efvb），產(chǎn)率約為25%。