高靈敏納米金比色芯片檢測(cè)乙型肝炎病毒DNA及其變異

摘 要 構(gòu)建了新型納米金比色芯片，利用Taq DNA連接酶的連接特異性，將其與乙型肝炎病毒DNA（HBVDNA）靶序列完全互補(bǔ)雜交的捕獲探針（固定在芯片上）和納米金修飾的探針連接成一條鏈，從而將納米金顆粒固定到芯片點(diǎn)陣上，再通過(guò)銀染反應(yīng)放大， 形成裸眼可見(jiàn)的顯色信息。通過(guò)點(diǎn)陣的位置及灰度，即可判斷HBVDNA靶序列的單堿基突變，并得出相對(duì)定量信息。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同濃度的HBVDNA靶序列進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示： 此技術(shù)對(duì)單堿基突變有很強(qiáng)的特異性識(shí)別能力，并且具有較高的靈敏度（約10 pmol/L），在10～100 pmol/L濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出較好的線性關(guān)系。該技術(shù)檢測(cè)時(shí)間短（＜1 h）、操作簡(jiǎn)單、不需要特殊的檢測(cè)設(shè)備，具有很好的臨床應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 乙型肝炎病毒； 納米金； 基因芯片； Taq DNA 連接酶

1 引 言

我國(guó)是乙型肝炎高發(fā)區(qū)，流行病學(xué)調(diào)查表明\\，我國(guó)至少有8億人感染過(guò)乙型肝炎，乙肝表面抗原的攜帶率曾高達(dá)9.75%。在乙肝的治療方案中，通過(guò)抗HBV藥物抑制HBV復(fù)制是最重要和有效的方法之一，因此HBVDNA的定量檢測(cè)和耐藥性變異檢測(cè)在HBV病理研究與臨床診斷中具有重要意義\\。HBVDNA檢測(cè)的傳統(tǒng)方法有直接測(cè)序、S基因序列測(cè)定、ELISA基因型分型法和PCRRFLP基因型分型法等\\。近年來(lái)，基因芯片技術(shù)開(kāi)始應(yīng)用于疾病的診斷，它具有靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確和操作迅速簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)。但由于采用示蹤探針標(biāo)記技術(shù)（酶、放射性同位素、熒光、化學(xué)發(fā)光等）比較昂貴，而且都有較高的儀器設(shè)備要求，限制了基因芯片在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用\\。

以納米金進(jìn)行示蹤標(biāo)記，結(jié)合納米金銀染增強(qiáng)技術(shù)，在基因芯片上可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA的檢測(cè)\\。李瑋等\\基于納米金探針開(kāi)發(fā)了可視化乙肝病毒基因芯片。但是，這些方法只能檢測(cè)DNA的濃度，而且對(duì)于雜交和清洗條件都有較高要求。本研究引入Taq DNA連接酶作為單堿基突變的識(shí)別工具，只需一步雜交和連接反應(yīng)，將納米金顆粒捕獲固定在芯片點(diǎn)陣上，再經(jīng)過(guò)銀染放大顯色即可判定結(jié)果，不僅可以檢測(cè)HBVDNA的濃度，而且可以識(shí)別HBVDNA的單堿基突變。本方法操作簡(jiǎn)單，不需要特殊的檢測(cè)設(shè)備，而且通過(guò)修改探針的設(shè)計(jì)即可用于其它DNA的檢測(cè)，具有很好的應(yīng)用前景。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Prosys5510A芯片點(diǎn)樣儀（美國(guó)Cartesian Technology公司）；V670紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)Jasco公司）；BX51顯微鏡和Qimage Retiga 2000R數(shù)碼相機(jī)（日本Olympus公司）；JEM2100透射電子顯微鏡（TEM，日本電子公司）；Centrifuge 5804R高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；DY501電泳儀（上海萬(wàn)達(dá)科技品格服務(wù)部）；Gel DocTM XR＋凝膠成像儀（美國(guó)BioRad公司）。

納米金溶液、基因芯片由本實(shí)驗(yàn)室自行制備；氯金酸（Acros Organics公司）；0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）；1.0 mol/L NaCl；0.2×SSC洗液（含0.1% SDS）；銀染液（將1%明膠溶液、5.7%氫醌溶液、25.5%檸檬酸23.5%檸檬酸三鈉的混合液、20% AgNO3溶液順序以120:60:20:3的比例迅速混勻，配好即用）；NaNO3洗液；目標(biāo)DNA和探針由上海生物工程技術(shù)有限公司合成（表1）。DNA連接酶（Taq DNA Ligase）及其反應(yīng)緩沖液由美國(guó)BioLab公司提供。其它試劑為分析純， 實(shí)驗(yàn)用水為超純水（美國(guó)Millipore公司MilliQ系統(tǒng)制備）。