米根霉胞內(nèi)氨基酸的高效液相色譜測(cè)定及其代謝途徑分析

摘 要 建立了米根霉胞內(nèi)代謝物提取方法定量評(píng)價(jià)體系，用100%甲醇作為提取劑獲得對(duì)米根霉胞內(nèi)能荷物質(zhì)最佳的提取效果。用HPLC法建立了米根霉產(chǎn)富馬酸體系胞內(nèi)18種氨基酸的含量測(cè)定方法。采用異硫氰酸苯酯（PITC）作為柱前衍生化試劑，所有氨基酸在28 min內(nèi)洗脫完畢。以Sepax AA柱（250 mm×4.6 mm， 5 m）為分析柱，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm， 以0.1 mol/L 醋酸鈉 （pH 6.5）乙腈 （93∶7， V/V） 為流動(dòng)相A，乙腈水 （80∶20， V/V） 為流動(dòng)相B，梯度洗脫。18種氨基酸在1.87～45.3 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.991；加標(biāo)回收率在96.3%～102.7%之間；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.6%～2.9% 之間。運(yùn)用本方法測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間米根霉胞內(nèi)氨基酸的含量，得到其在發(fā)酵過程中的變化趨勢(shì)，并結(jié)合氨基酸代謝途徑分析了該發(fā)酵條件下富馬酸產(chǎn)量偏低的原因。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法； 柱前衍生化； 氨基酸； 米根霉

1 引 言

以米根霉為代表的絲狀真菌是重要的工業(yè)生產(chǎn)菌，目前作為生物反應(yīng)器被廣泛應(yīng)用于酶、抗生素、有機(jī)酸等物質(zhì)的生產(chǎn)\\。對(duì)工業(yè)微生物進(jìn)行胞內(nèi)氨基酸分析有助于從整體上了解細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的代謝過程。但該類絲狀真菌的細(xì)胞壁組成較復(fù)雜，樣品預(yù)處理難度加大，會(huì)影響后續(xù)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性，因此急待建立其預(yù)處理評(píng)價(jià)體系。由于ATP， ADP， NAD等能荷物質(zhì)的穩(wěn)定性差，且均為微生物代謝過程中對(duì)生理活性影響較大的代謝產(chǎn)物，因此是驗(yàn)證提取方法的高效性及穩(wěn)定性的最佳內(nèi)標(biāo)物\\。

本研究建立了以于ATP， ADP， NAD為代表的能荷物質(zhì)的預(yù)處理評(píng)價(jià)體系。并在此基礎(chǔ)上，以異硫氰酸苯酯（PITC）為柱前衍生劑\\，分析了米根霉產(chǎn)富馬酸體系胞內(nèi)18種氨基酸，同時(shí)驗(yàn)證了該預(yù)處理方法的有效性。并從發(fā)酵過程中氨基酸含量的變化對(duì)米根霉產(chǎn)富馬酸的代謝途徑進(jìn)行了解析。2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Summit高效液相色譜儀（美國(guó)戴安公司），由P680 HPLC泵、UVD170可變紫外檢測(cè)器、TCC2100柱溫箱、8125型進(jìn)樣裝置組成；工作站（美國(guó)戴安Chromeleon系統(tǒng)）；Centrifuge 580R低溫離心機(jī)（美國(guó)Eppendorf公司）；MDFU32V超低溫冰箱80 ℃（日本SANYO公司）；RE52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

3種能荷物質(zhì)（ATP， ADP， NAD）對(duì)照品，18種氨基酸對(duì)照品均購(gòu)自Sigma公司；乙腈（色譜純），其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為飲用純凈水。米根霉誘變菌株MEF12（Rhizopus Oryzae MEF12，南京工業(yè)大學(xué)代謝工程實(shí)驗(yàn)室保藏）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 培養(yǎng)基制備 （1）種子培養(yǎng)基 葡萄糖40 g/L，KH2PO4 0.1 g/L，MgSO4 0.5 g/L，ZnSO4 17.6 mg/L，F(xiàn)eSO4 4.98 mg/L，pH 2.4；（2）發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖 40 g/L，Urea 0.1 g/L，KH2PO4 0.1 g/L，MgSO4 0.5 g/L，ZnSO4 17.6 mg/L，F(xiàn)eSO4 4.98 mg/L。

2.2.2 發(fā)酵步驟 取1 mL米根霉孢子懸浮液 （濃度106個(gè)/mL）接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角平底瓶中，在35 ℃，200 r/min條件下恒溫?fù)u床培養(yǎng)30 h得到種子液，接入7 L發(fā)酵罐（NBS）發(fā)酵。發(fā)酵條件：溫度35 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min，裝液量5 L，接種量10%，通氣量3.0 L/min，pH值由4 mol/L氨水控制在4.0。

2.2.3 殘?zhí)菧y(cè)定 取10 mL發(fā)酵上清液至10 mL容量瓶?jī)?nèi)，定容后用SBA40c測(cè)糖儀測(cè)定殘?zhí)恰＊?/p>

2.2.4 富馬酸測(cè)定 取發(fā)酵混勻液1 mL至10 mL離心管中，再加入1 mL H2SO4和3 mL去離子水，80 ℃水浴加熱20 min后，取上清液0.5 mL定容到10 mL，用HPLC檢測(cè)\\。