HSP70與惡性腫瘤關系的研究進展

游朝勇綜述 馮一中審校

熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)又稱應激蛋白(stress protein，sp)，是生物體細胞在熱誘導下合成的一組具有高度保守性的蛋白質[1]。近年來，HSPs被發(fā)現(xiàn)與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)及預后關系密切。

1 HSP70的研究進展

1.1 HSP70的發(fā)現(xiàn)及演變過程

1962年，Ritossa把25℃培育的果蠅幼蟲置于32℃熱環(huán)境中，30 min后發(fā)現(xiàn)果蠅唾液腺染色體上出現(xiàn)膨突(puff)，提示該區(qū)域的基因轉錄增強，推測有新的蛋白質合成，Ritossa稱之為熱休克反應。1974年，Tusseres用SDS--PAGE電泳放射自顯影發(fā)現(xiàn)，置于熱環(huán)境中的果蠅唾液腺、腦及其它組織中，許多正常蛋白質的合成減少，卻合成一組特殊的蛋白質，從而證實了溫度增高而引起的果蠅染色體產生的“膨突”是由于熱休克反應激發(fā)了染色體內的基因發(fā)生轉錄，合成了特異的蛋白質，并命名為“熱休克蛋白”。進入80年代后，Pelbam于1986年提出了HSP是1種分子伴侶的理論；Nover與Soger分別于1984年和1987年闡明了編碼HSP的序列、基因結構及其位點，并且確定了是由于高熱影響到該基因中保守的上游調節(jié)序列，即熱休克元件(heat shock element，HSE)而引起熱休克應答，從而編碼轉錄合成HSP，將HSP功能與調控的研究上升到了1個新的高度。

1.2 HSP的分類及HSP70分子結構

現(xiàn)已證明幾乎所有的活細胞都可被誘導出熱休克蛋白，在多種多樣的應激因素中，除了非致死性熱休克外，還包括一些應激原如環(huán)境低溫、缺氧、重金屬中毒、氧化應激、感染、饑餓、創(chuàng)傷、代謝毒物、氧化反應、化學物質(如乙醛、亞砷酸鈉等)、放射線、某些線粒體呼吸鏈抑制劑、癲癇以及某些藥物(如鉀離子通道激動劑，腺苷受體激動劑等)。在應激條件誘導下，HSP基因高效表達的熱休克蛋白，是廣泛存在于生物界中高度保守的一組蛋白質[2]。HSPs在體內可與多種蛋白形成復合體，陪伴蛋白分子在細胞內轉運、跨膜，參與蛋白質的折疊與伸展、多聚復合體的組裝，發(fā)揮其調節(jié)靶蛋白的作用，但又不改變靶蛋白的結構[3]，故熱休克蛋白又被稱作“分子伴侶[4]”(molecularchaperone)。HSPs分為6個家系，分別是：HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSP及泛素。在眾多的熱休克蛋白中分子量為70 kD左右的HSP70家族，是被研究的較為深入的1種。按照其表達情況將HSP70分為構成型和誘導型，而構成型HSP70又可分為2種，分別位于內質網和線粒體內。HSP70家族分成：① HSP73(組成型HSP70)，分布于胞核與胞質；② HSP72(誘導型HSP70)，分布于胞核與胞質；③ GRP78，分布于內質網腔內；④ GRP75，分布于線粒體中。其中HSP73和HSP72的同源性達95%，HSP73，GRP75，GRF78存在于非應激的正常細胞中，正常細胞中即可表達，而HSP72僅出現(xiàn)在應激細胞中。各種生物的HSP70及其編碼基因均具有進化上的高度保守性，原核生物和真核生物的HSP70有40%～60%的同源性，而不同來源的真核生物其同源性為60%～78%。人類的HSP70相關基因定位于第6號染色體短臂、第14號和第21號等多條染色體上。

HSP70蛋白分為3個結構域：氨基端(1-383)的ATP結合域(ATPbindingdomain，ATP-BD)，有ATP酶活性，可使ATP水解，較C端具有更高的保守性；中心區(qū)(384-542)的肽結合部位(peptide binding domain，PBD)，可結合新生肽段，受損的蛋白質；羧基端(543-646)高度保守的末端順序，可影響HSP70 mRNA 翻譯的數量。

1.3 HSP70生物學功能

HSP70主要的生物學功能是在應激狀態(tài)下保護細胞生命活動必需的蛋白質以維持細胞的生存，主要表現(xiàn)在以下幾個方面：①結合其他蛋白質，介導其他蛋白質的折疊和裝配；②蛋白質的定位和轉運；③參與蛋白質的水解，防止蛋白質聚集；④參與細胞骨架和核骨架之中，活化其他細胞基因；⑤與癌基因或抑癌基因蛋白作用，參與腫瘤的發(fā)生、增殖分化及抗腫瘤免疫。HSP70的作用具有以下特點：①HSP70正常狀態(tài)下水平較低，而應激狀態(tài)下表達顯著提高；②平時HSP70主要存在于胞質中，應激時HSP70迅速進入胞核；③多種因素可誘導HSP70大量產生，具有應激反應普遍性，其誘導合成在轉錄和翻譯2個水平上調節(jié)；④HSP70能提高細胞抗應激能力，如HSP70生成量與細胞的熱耐受能力呈正相關。

2 HSP70與惡性腫瘤的關系

2.1 HSP70與腫瘤細胞增殖

作為熱休克蛋白家族中的重要成員，HSP70能促進腫瘤細胞的生長。HSP70在多種腫瘤組織中表達異常[5]，與腫瘤的發(fā)生，發(fā)展，腫瘤免疫，腫瘤治療中耐藥性和腫瘤的預后等都有密切關系。HSP70與腫瘤的關系已經引起廣泛的重視。腫瘤是機體在內，外因素相互作用下發(fā)生的與機體生長不協(xié)調的異常增殖群，具有無限增殖的特點，其自身增長需要大量HSP70來調節(jié)。正常細胞僅表達少量HSP70，HSP70參與細胞的生長代謝，并受細胞周期的嚴格調控；而腫瘤細胞即使在無應激條件下，也能獨立于細胞周期持續(xù)高表達誘導型HSP70，并出現(xiàn)異常分布和定位。如卵巢癌細胞中HSP70的表達較正常卵巢細胞高幾倍[6]，免疫組織化學的口腔鱗癌表達更高。2002年，Beer等顯示HSP70在早期肺腺癌中過表達是1個不良預后的分子標志物[7]。2003年，Kanazawa等認為：大腸癌組織對HSP70和HSP40表現(xiàn)出特殊的免疫反應性，分別為84%和14%[8]。卵巢癌細胞中HSP70的表達較正常卵巢細胞高幾倍[9]。HSP70也可能是早期肝細胞性肝癌的敏感指標[10]。 Nylandsted等[11]首次發(fā)現(xiàn)了HSP70的損耗將導致乳腺癌、結腸癌、前列腺癌、成膠質細胞瘤和肝癌等細胞系的死亡，并且HSP70的表達是人類癌細胞存活的先決條件。趙霞等[12]研究HSP70反義寡聚核苷酸阻斷Molt-4等腫瘤細胞的內源性HSP70表達，發(fā)現(xiàn)HSP70反義寡聚核苷酸的使用可以誘導腫瘤細胞的凋亡，抑制腫瘤細胞的增殖，說明HSP70的表達有助于腫瘤細胞的生存和增殖。

2.2 HSP70與腫瘤細胞凋亡

HSP70還參與了腫瘤細胞的凋亡，主要認為HSP70是通過線粒體途徑和受體途徑來介導腫瘤細胞凋亡的。HSP70參與細胞凋亡的機制：①已知抑癌基因p53可促進凋亡的發(fā)生，當染色體17 p等位基因缺失時可產生突變型p53蛋白，這種蛋白可抑制野生型p53蛋白而阻止凋亡的發(fā)生[13]，HSP70可通過阻止突變型p53蛋白的降解來阻止細胞的凋亡[14]；②應激活化激酶JNK(C-JNK N-terminal k=inase)可以活化轉錄因子AP-1來調節(jié)細胞的增殖、炎癥和凋亡，HSP70可以通過抑制JNK的去磷酸化來介導凋亡；③由于細胞色素C從線粒體中釋放出來后可與凋亡蛋白激酶活化因子1連接，在ATP/dATP依賴狀態(tài)下活化Caspase-9?；罨腃aspase具有活化自生酶原和Caspase-3的能力，故可放大Caspase的級聯(lián)反應，而且Caspase-9和Apaf-1的連接是Caspase級聯(lián)活化的關鍵，且兩者是通過的Caspase恢復結構域CAPD連接在一起的。HSP70可通過與Caspase-9競爭Apaf-1的CARD結構序列而導致Caspase-9的失活，從而影響細胞質內Caspase的級聯(lián)反應，抑制凋亡。HSP70對熱、電離輻射、氧化應激等引起的凋亡具有保護作用。溫和熱處理和轉染HSP70基因誘導的HSP70表達與細胞對有毒物質誘導的細胞凋亡的抗性相關，HSP70的高表達可以對熱誘導的細胞凋亡起到抑制作用。Inchi等研究表明聯(lián)合使用非白血性白細胞病細胞衍生的HSP70與樹突狀細胞可通過誘導特異性細胞毒CD8+T細胞，從而安全有效地消除微量殘留白血病[15]。同時HSP70還可通過細胞凋亡機制促進腫瘤細胞的減滅，Aghdassi等用槲皮素去除HSP70在細胞凋亡中具有重要作用，選擇性去除HSP70可以用來誘導胰腺癌細胞的凋亡[16]。

2.3 HSP70與腫瘤免疫

在腫瘤細胞表面的HSP70可以引發(fā)針對該腫瘤細胞的特異性免疫，并與DC(樹突狀細胞)抗腫瘤作用有關[17]。腫瘤細胞自身呈遞抗原效率非常低下，原因在于腫瘤細胞MHC Ⅰ類分子往往低表達以及共同刺激分子缺乏。因此，具有腫瘤特異性的CD4+和CD8+淋巴細胞的激活必須依賴于抗原呈遞細胞的幫助，在由抗原呈遞細胞將內源性抗原和外源性抗原，經MHCⅠ類分子途徑和MHCⅡ類分子途徑，分別將抗原信息呈遞給CD8+T淋巴細胞和CD4+T淋巴細胞，通過自然殺傷(natural killer，NK)細胞發(fā)揮作用，同時激活輔助性T淋巴細胞釋放細胞因子，再經細胞免疫途徑發(fā)揮抗腫瘤的作用。

腫瘤的免疫主要是由T淋巴細胞介導的，而HSP70又與T淋巴細胞的增殖密切相關，可以促進它的增殖[18]。眾所周知，抗腫瘤的肽合成物經由MHCⅠ類分子途徑與外源性抗原雜交可以誘導CD8+T淋巴細胞免疫，但是他們激活CD4+T淋巴細胞的作用機制并不是很清楚。直到近來的一些研究表明，HSP70能夠通過MHCⅡ類分子呈遞途徑，增強機體的特異性CD4+T細胞反應[19]，而帶有HSP70復合物形成的抗原肽，在引發(fā)特定性抗原擴增的過程中是完全必要的。由此可以看出，HSP70不但可以增強特異性抗原CD4+T細胞的繁殖，而且還可以增強肽合成物在人類CD4+T細胞中的免疫原性。與普通細胞相比，腫瘤細胞內含有選擇性的膜HSP70。這種腫瘤選擇性膜HSP70的表達已經證實了與人類NK細胞介導的溶解的敏感性增強有關。單核細胞通過CD14依賴的信號通路分泌促炎癥反應的細胞因子來適應可溶性的HSP70蛋白，并且結合在細胞膜表面的HSP70作為1種由NK細胞介導的細胞溶解攻擊靶組織而被識別[20]。大量的實驗證明，HSP70的高表達有保護腫瘤細胞的作用，但也有實驗表明，在用帶有差異性膜HSP70表達模式的自體腫瘤亞系細胞中，HSP70高表達的惡性腫瘤細胞比HSP70低表達的惡性腫瘤細胞更容易被NK細胞殺死。Gough MJ等[21]研究，經過細胞凋亡作用的巨噬細胞可以使HSP70顯著地抑制IL-10的分泌和細胞碎片的吞噬作用。而單獨的巨噬細胞不能使HSP70產生免疫性刺激?？墒?，當巨噬細胞在具有細胞殺傷能力的時候，HSP70就明顯扮演了激活巨噬細胞信號的關鍵分子。DC(樹狀突細胞)其表面存在HSP70 高親和力的CD91受體，而腫瘤細胞的抗原肽與HSP70結合可誘導DC成熟；而成熟的DC刺激未致敏的T細胞的能力增強，從而能夠誘發(fā)機體T淋巴細胞的抗腫瘤免疫效應，有效地殺傷腫瘤細胞[22，23]。而DC作為1種專職呈遞細胞，其呈遞能力最為強大，它能夠有效攝取、加工腫瘤抗原，再經MHCⅠ類分子、MHCⅡ類分子途徑呈遞給T淋巴細胞和B淋巴細胞，使之激活，產生特異性的抗腫瘤免疫應答。

2.4 HSP70與腫瘤的治療

腫瘤的治療有多種，目前主要有2種治療研究較多，一種是腫瘤的免疫治療，盡管現(xiàn)在可以針對許多種腫瘤產生針對性的抗腫瘤免疫，但大多數的腫瘤細胞在腫瘤表達的過程中會產生耐受的現(xiàn)象。這些耐受的現(xiàn)象包括很多機制，像腫瘤細胞T淋巴細胞的殺傷力的減弱，MHCⅠ類分子的調節(jié)低下、免疫監(jiān)視的逃脫和腫瘤抗原耐受性的增強等。Calderwood等[24]，認為細胞外的HSP70是腫瘤免疫治療的有效試劑，它能夠阻斷腫瘤相關抗原耐受過程，并且通過細胞毒素CD8+T淋巴細胞殺傷特定的腫瘤細胞。FU等[25]將HSP70與白細胞介素2(IL-2)以不同的計量和時間間隔分別注入已移植出腫瘤的老鼠體內，實驗結果表明HSP70比IL-2能更有效的抑制腫瘤的生長或者在不同程度上延長老鼠的壽命，而在兩者復合治療過程中HSP70在延長和消除腫瘤的作用中也起到了主要的作用。另一種是腫瘤的基因治療?；蛑委煹哪康氖钦T導轉基因表達的緊密間隙和時序控制，關于可誘導的基因啟動子在用于自殺基因的調控上有很多種途徑。Schmidt等[26]，在體外分別用頭、頸部2種穩(wěn)定的細胞株進行試驗，將2種啟動子分別作用于2種細胞株并且用熒光激活細胞分類技術、蛋白印跡分析技術和熒光顯微鏡檢查技術分析測量這2種因子對基因活化的作用。結果表明HSP70啟動子在2種細胞株中的1種，其基因活性是已報道基因表達活性的5.83倍。因此，HSP70啟動子為基因治療提供了1種有用的途徑。同時，熱誘導的HSP70啟動子用于基因治療的這個特性在體內和體外等許多的腫瘤株中也得到了證實[27]。另外國內也有文獻報道在胃癌、宮頸癌細胞中HSP70 mRNA大大增強的結果。為應對這種變化，細胞就需要合成足夠量的HSP70。因此，其調控機制就促進HSP70基因大量合成mRNA，從而使HSP70呈現(xiàn)高表達。而高表達HSP70可以抑制腫瘤細胞死亡，使腫瘤細胞產生耐受，如果通過抑制mRNA的轉錄可以減少HSP70表達,就可以有效地殺傷腫瘤細胞，從而就可以為腫瘤的基因治療提供1個新的途徑。

總之，HSP70作為分子伴侶的1種，在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達，與大部分惡性腫瘤細胞的增殖、凋亡及預后關系密切，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用。明確HSP70的調控機制及作用過程，將有利于腫瘤發(fā)病機制的闡明，并為腫瘤的診治提供更充分的理論依據。隨著生物技術的發(fā)展，HSP70將作為治療腫瘤的靶點，并以此為腫瘤治療設計新的抗癌藥物。HSP70反義RNA可阻斷腫瘤細胞HSP70的表達，阻止腫瘤細胞中蛋白的合成，抑制腫瘤細胞增生。腫瘤細胞中可提取可溶性HSP(主要是HSP90，HSP70及gp96)，制成HSP-PC疫苗，用于治療腫瘤，這些都為腫瘤的治療提供了1個新的思路，是我們研究的方向。

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