阿卡波糖含量檢測方法的試驗分析

尹靈富

（臺州市疾病預(yù)防控制中心，浙江 臺州 318000）

1 實驗材料

（1）實驗原料：發(fā)酵液:阿卡波糖發(fā)酵液。

（2）實驗試劑：乙睛(色譜純）、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、純凈水、微孔濾膜、無水乙醇(分析純)、丙酮(分析純)、鹽酸、氫氧化鈉。

（3）實驗儀器：高效液相色譜儀、色譜柱、AT-330柱溫箱、磁力攪拌器、分析天平。

2 實驗方法

（1）HPLC檢測阿卡波糖含量方法的確立：①發(fā)酵上清液的獲得，離心:將發(fā)酵液在12000r/min下低溫離心10min得發(fā)酵上清液。②液相檢測條件的確定，文獻(xiàn)報道阿卡波糖在UV210nm處有吸收，并參考中國藥典阿卡波糖檢測條件流動相配比，經(jīng)過多次實驗摸索初步確定的色譜條件如下：色譜柱:氨基柱sgar-D,size4.6X250mm、流動相:乙睛:PBS=70:30、檢測波長:210nm、流速:0.8m1/min、進(jìn)樣量:20ul。③阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)品的線性考察。由于需要采用外標(biāo)法或標(biāo)準(zhǔn)曲線法對阿卡波糖發(fā)酵液及其在樹脂柱的洗脫液進(jìn)行含量計算，所以要考察阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)品的線性以便為準(zhǔn)確計算含量提供可靠科學(xué)依據(jù)。標(biāo)準(zhǔn)品配制:用分析天平精確稱取一定量的阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)品，用重蒸水配成濃度分別100ug/ml,200ug/ml,300ug/ml、400ug/ml、500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml、800ug/ml的溶液。將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品用0.45urn的水膜過濾后可進(jìn)行HPLC檢測。用上述液相檢測條件對不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，將濃度對峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線。④HPLC檢測時稀釋倍數(shù)考察。取發(fā)酵上清液1ml用流動相分別稀釋成4倍、5倍、6倍、7倍、8倍后，于4000r/min轉(zhuǎn)速下離心10min后，取樣品上清液用0.45um的酷膜過濾后即可進(jìn)行HPLC檢測，用500ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)品做對照效價計算。

（2）阿卡波糖理化性質(zhì)的考察。在提取過程中為保證生物效價不降低，對它的標(biāo)準(zhǔn)品和發(fā)酵上清液的一些理化性質(zhì)如溶解性、穩(wěn)定性及旋光性等進(jìn)行了考察，為分離純化提供參考依據(jù)。

阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)品：①外觀:阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)品為白色粉末；②溶解度:極易溶于水，微溶于95%乙醇，不溶于丙酮、無水乙醇、乙睛。對其在水中的溶解度進(jìn)行了考察。③穩(wěn)定性考察。冰箱4℃冷藏，取濃度為500ug/ml阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)品(蒸餾水配制)置于冰箱4℃冷藏室，一個月取一次樣品，將樣品用0.45um的水膜過濾后進(jìn)行液相檢測，考察效價變化。穩(wěn)定pH值范圍，用0.2%鹽酸及0.2%氫氧化鈉將蒸餾水pH值分別調(diào)成為1.5,3,4.5,6,6.8、8.5,9.5,10.5,11.5的水溶液，用該水溶液分別配制濃度為600ug/ml阿卡波糖標(biāo)品。對照品是用未調(diào)pH蒸餾水配制。配制完在室溫27℃放置二小時后取樣，將樣品用0.45um的水膜過濾后即可進(jìn)行液相檢測，考察效價變化。熱穩(wěn)定性，分別取15ml濃度為800ug/ml阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)品用稀鹽酸或稀堿調(diào)成pH分別為1.5，4，9，10的溶液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀溫度控制在47℃～49℃之間旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20min濃縮成體積都為8.5m1，將樣品用0.45um的水膜過濾后進(jìn)行HPLC效價檢測。④旋光性，用0.2%鹽酸及0.2氫氧化鈉將蒸餾水調(diào)pH值分別為1.5，3，4.5，6，6.8，8.5，9.5，10.5，11.5的水溶液，用該水溶液配成濃度為3%的阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)品，用未調(diào)pH值的蒸餾水配制對照品。配完后在室溫27℃放置半小時，取樣進(jìn)行旋光測定。

（3）阿卡波糖發(fā)酵上清液。由于在提取過程中需要調(diào)節(jié)發(fā)酵上清液的pH值便于樹脂吸附，所以要考察發(fā)酵上清液的pH值穩(wěn)定性。同時在提取后期需要用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮洗脫液，這樣要考察發(fā)酵上清液的熱穩(wěn)定性。并且在保藏方面要考察冰箱冷凍保藏發(fā)酵液的穩(wěn)定性。所以針對上述這三點對其穩(wěn)定性進(jìn)行考察。①熱穩(wěn)定性。取發(fā)酵上清液各1ml置于離心管中，放于水浴溫度分別為30℃、40℃、50℃水浴鍋中保溫1h，取出后按照2.1的方法進(jìn)行液相檢測。然后取3份發(fā)酵上清液各1ml置于離心管中，在水浴47℃下分別放置20min、30min、40min，取出后同樣按照2.1的方法進(jìn)行液相檢測。②保藏穩(wěn)定性，將發(fā)酵上清液置于冰箱冷凍層-20℃冷藏，于1個月、2個月、3個月、4個月后取樣。取樣品后按照2.1的方法進(jìn)行液相檢測。③穩(wěn)定pH值范圍，用0.2%鹽酸、0.2%氫氧化鈉將發(fā)酵上清液pH調(diào)成4，5，6，8，9，10后放置2h，然后取樣品按照2.1的方法進(jìn)行HPLC檢測，考察效價變化。

3 結(jié)語

（1）首先確定了阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度在100ug/m1～800ug/ml之間線性良好，可以用外標(biāo)法來計算發(fā)酵上清液的效價。其次，確定了HPLC檢測阿卡波糖發(fā)酵上清液時的稀釋倍數(shù)為4倍。

（2）考察了阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)品的理化性質(zhì)，首先是溶解度，在水溶液中溶解度達(dá)到714mg/ml時溶液已很粘稠欲接近飽和但仍未飽和。其次是穩(wěn)定性，第一點是保藏穩(wěn)定性考察，確定了阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)品在4℃冰箱里保存至四個月時，效價幾乎不變。第二點是穩(wěn)定pH值范圍，標(biāo)準(zhǔn)品在pH值5.5～6.8的水溶液中比較穩(wěn)定。第三點是熱穩(wěn)定性考察，阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)品在酸性pH<4、堿性pH>9時47℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)不穩(wěn)定，易分解而導(dǎo)致效價降低，其中酸性條件下比堿性條件下降低得要明顯。第四點是旋光性考察，標(biāo)準(zhǔn)品在p H值為1.5時旋光度比其它pH值時都要大，其它pH值的標(biāo)準(zhǔn)品溶液旋光度基本都一致。

（3）考察了阿卡波糖發(fā)酵上清液的理化性質(zhì)，阿卡波糖發(fā)酵上清液在40℃時加熱一小時活性基本無變化，同時確定在水浴47℃40min郵可卡波糖活性物質(zhì)基本不會損失。保藏穩(wěn)定性考察確定在一20℃保藏至3個月時效價基本降低一半。確定了效價穩(wěn)定的pH值范圍在6～7之間。