氣體信號分子硫化氫與缺血再灌注損傷

王新寶

(首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院兒科，北京 100050)

氣體信號分子具有持續(xù)產(chǎn)生、迅速彌散、作用廣泛等特點，在機體中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，近年來研究［1-3］發(fā)現(xiàn)硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是繼內(nèi)源性氣體分子一氧化氮(notric oxide，NO)和一氧化碳(carbon monoxide，CO)之后的第3種氣體信號分子，在機體中發(fā)揮著重要的生物學作用，是目前生物學研究領(lǐng)域的熱點之一。隨著目前導(dǎo)管技術(shù)、動脈搭橋技術(shù)、冠狀動脈血管成形術(shù)、心肺復(fù)蘇、體外循環(huán)開胸直視手術(shù)、斷指再植和器官移植等新技術(shù)的應(yīng)用，缺血再灌注損傷更為常見，探索減輕缺血再灌注(ischemic reperfusion，I/R)損傷的方法具有重要的生物學意義，本文就H2S在I/R損傷中的作用和機制進行了綜述。

1 內(nèi)源性H2S的生成與代謝

H2S在體內(nèi)可以通過胱硫酸-β-合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)、胱硫醚 －γ －裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)的催化作用，以半胱氨酸為底物產(chǎn)生，CSE主要存在于心血管組織中，而CBS主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)［3］，在線粒體內(nèi)，則以巰基丙酮酸為底物，在巰基丙酮酸轉(zhuǎn)硫酶(mercaptopyruvate transsulphurase，MPST)的作用下產(chǎn)生 H2S［4-5］，H2S 在體內(nèi)大部分通過氧化代謝生成硫代硫酸鹽和硫酸鹽，然后經(jīng)腎臟排出體外。

2 H2S與器官缺血再灌注損傷

研究［6-17］表明H2S可以明顯減輕心臟、肺、肝臟、腎臟和小腸的I/R損傷，對組織器官的I/R具有廣泛的保護作用。

2.1 H2S減輕心臟I/R損傷

在離體心肌細胞中，給予100 μmol/L的硫氫化鈉(H2S供體，NaHS)30 min，然后培養(yǎng)20 h，再進行I/R(5 min/10 min)處理，研究［18］發(fā)現(xiàn) NaHS使細胞活性增強，而給予環(huán)氧酶－2(COX-2)抑制劑NS-398可使NaHS的保護作用消失，同時NaHS上調(diào)COX-2的表達和前列腺素E2(prostaglanding E2，PGE2)產(chǎn)生，給予KATP抑制劑格列本脲和PKC抑制劑chelerythrine可使NaHS對COX-2的誘導(dǎo)效應(yīng)消失，給予一氧化氮合酶抑制劑 NG-硝基-L-精氨酸甲酯對COX-2的表達無明顯影響，但可抑制NaHS上調(diào)COX-2的表達和PGE2產(chǎn)生作用，上述研究表明NaHS的心肌保護效應(yīng)可能通過KATP/PKC依賴的對COX-2的誘導(dǎo)表達和NO誘導(dǎo)的COX-2的活性途徑發(fā)揮作用，同時KATP/PKC/ERK1/2和PI3K/Akt也參與了NaHS的心肌保護作用［19］。在離體大鼠心臟I/R(40 min/120 min)模型中，在缺血前10 min給予 NaHS(40 μmol/L)，H2S的心肌保護作用可能與激活熱休克蛋白72表達有關(guān)［20］。在離體灌流心臟I/R(30 min/90 min)大鼠模型中，1 μmol/L NaHS可明顯降低I/R后心肌梗死面積，KATP抑制劑格列本脲和5-HD可抑制NaHS的心肌保護作用［21］。在離體灌流心臟I/R(40 min/60 min)大鼠模型中，內(nèi)源性H2S介導(dǎo)了缺血后處理的心肌保護作用，并且H2S后處理(間斷給予NaHS 6次，每次10 s或給予NaHS 2 min)通過激活A(yù)kt、PKC和eNOS途徑減輕I/R 損傷［22］。

Calvert J W 等［23］利用在體小鼠心臟 I/R(45 min/24 h)模型，在缺血前24 h給予Na2S(100 μg/kg，iv)，研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死面積減少46%，在早期(再灌注后30 min和2 h)，H2S使核內(nèi)的nrf2(一種調(diào)節(jié)抗氧化基因表達的調(diào)節(jié)因子)基因表達增高，并使血紅素加氧酶－1表達增高;在再灌注后24 h，H2S可使熱休克蛋白90、熱休克蛋白70、Bcl-2、Bcl-xL和環(huán)氧酶－2增高，并使凋亡前基因bad滅活，H2S的心肌保護作用與抗氧化和抗凋亡的信號有關(guān)。在大鼠心臟I/R(25 min/120 min)模型中，NaHS可明顯降低缺血區(qū)caspase 9活性，使Bcl-2表達降低，上述作用可被5-HD抑制，進一步的研究［24］表明NaHS可降低 p38 MAPK和JNK的表達、抑制p65 NF-κb基因轉(zhuǎn)位和細胞內(nèi)黏附分子的表達，減輕多形核白細胞的聚集，降低髓過氧化物酶的活性，上述研究表明H2S的心肌保護作用與抗凋亡和抗炎性反應(yīng)有關(guān)。在豬的心臟I/R(60 min/120 min)中，在缺血前10 min給予Na2S(100 μg·kg－1bolus+1 mg·kg－1·h－1infusion)，可明顯降低心肌梗死面積，減少細胞凋亡，降低caspase-3和PARP 表達［25-26］。Sodha N R 等［27］采用豬的在體心臟I/R(60 min/120 min)模型，在缺血前10 min給予Na2S(100 μg/kg)，可使心肌梗死面積減少2.3倍，同時組織中白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-8、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)和髓過氧化物酶的水平明顯降低。

2.2 H2S減輕腦I/R損傷

Florian B等［28］采用大鼠暴露于 H2S氣體(含80ppm H2S和19.5%O2)中2 d，發(fā)現(xiàn)大鼠腦中的H2S含量增高，誘導(dǎo)了一定程度的低體溫，使梗死面積減少50%，進一步采用胎兒小鼠子宮內(nèi)I/R(5 min/24 h)模型，研究發(fā)現(xiàn)胎兒小鼠腦中谷胱甘肽(glutathione，GSH)水平降低 24%，而在缺血前給予 H2S(0.437 5 μmol/kg，i.p.15 min)，可改善胎鼠腦中GSH 水平［29］。Minamishima S 等［25］研究在心臟驟停/心肺復(fù)蘇的小鼠模型中，給予H2S(0.55 mg/kg)能改善神經(jīng)系統(tǒng)的功能，降低凋亡蛋白caspase-3的激活，同時增強腦皮質(zhì)抗凋亡蛋白GSK-3β的磷酸化。另外H2S可通過促進谷胱甘肽的產(chǎn)生而保護神經(jīng)元免受氧化損傷［30］。NaHS(0.05 －0.01 mmol/L)減輕蛋氨酸誘導(dǎo)的腦內(nèi)皮細胞過氧化氮和超氧陰離子所致的氧化損傷，減少腦細胞的死亡［31］。Qu K 等［32］采用大鼠大腦中動脈栓塞模型發(fā)現(xiàn)，在阻塞前給予0.18 mmol/kg NaHS，使梗死的容積增大150%，給以CBS和CSE抑制劑明顯減少了梗死容積，上述研究結(jié)果的不同可能與給藥方式和劑量不同有關(guān)。

2.3 H2S減輕肺I/R損傷

在離體大鼠肺I/R(45 min/45 min)模型中，研究發(fā)現(xiàn)I/R使肺組織中H2S增加54%，CSE活性增加43%，在缺血前5 min給予H2S氣體溶液(50 μmol/L或100 μmol/L)，降低了MDA的產(chǎn)生，同時使SOD和CAT的活性增強，抑制了自由基的產(chǎn)生，減輕了肺I/R損傷，說明內(nèi)源性H2S對肺I/R損傷的保護作用與減少自由基的生成有關(guān)［14］。

2.4 H2S減輕肝臟I/R損傷

在小鼠的肝臟I/R(60 min/5 h)模型中，H2S可降低I/R后血清中的血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和血清門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)，H2S介導(dǎo)的細胞保護作用與改善GSH和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的平衡相關(guān)，減少脂質(zhì)過氧化的形成，同時H2S通過增強HSP-90和Bcl-2的表達抑制I/R誘導(dǎo)的細胞凋亡［13］。在大鼠肝臟缺血30 min，再灌注后1、3 和6 h，發(fā)現(xiàn)I/R后各時間點的血清中H2S水平和CSE活性增高，血清中TNF-α水平和肝臟TNF-α蛋白表達增高，而給予NaHS后，血清中TNF-α水平和肝臟TNF-α蛋白表達降低，PAG可加重肝臟I/R損傷，上述研究表明H2S通過抑制炎性反應(yīng)、抑制凋亡而減輕肝臟I/R 損傷［33］。H2S(14 μmol/kg)可明顯降低 I/R 后脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)生，抑制炎性反應(yīng)因子(包括NO、TNF-α、IL-10和細胞內(nèi)黏附分子1)，減少細胞凋亡，降低細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達，包括caspase-3、Fas和TNF-α表達，而PAG可加重上述指標的變化［34］。

2.5 H2S減輕小腸I/R損傷

在體外培養(yǎng)的大鼠腸細胞分別缺氧1 h、2 h或3 h，均復(fù)氧3 h，NaHS均在缺氧(或缺血)前20 min中給予，H2S(10 μmol/L)可使缺氧1 h的細胞凋亡指數(shù)明顯減低;缺氧 3 h 后給予 1 μmol/L、10 μmol/L 和100 μmol/L H2S同樣可使細胞凋亡指數(shù)明顯降低。在大鼠體內(nèi)H2S(10或100 μmol/L)可使I/R(1 h/3 h)的腸保持正常的顏色、絨毛形態(tài)，缺血2 h再灌注3 h后，只有10 μmol/L H2S處理的腸沒有損傷，上述研究表明H2S可明顯減輕腸的I/R損傷［35］。但是有趣的是，在隨后的研究中，NaHS均在缺氧或缺血前20 min中給予，體外腸細胞培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，10 μmol/L H2S在腸細胞缺氧1、2或3 h時均能降低細胞凋亡指數(shù)，而100 μmol/L H2S只在缺氧2 h時能降低凋亡指數(shù);在體內(nèi)腸 I/R中，在缺血 1 h，10或 100 μmol/L H2S均能減輕 I/R 損傷，缺血2 h，10 μmol/L H2S能減輕腸損傷而100 μmol/L H2S不具有上述作用，在缺血3 h時，均不具有減輕腸損傷的作用［7］，上述研究表明H2S對腸I/R損傷的保護作用與給藥時間和濃度有一定的關(guān)系。

2.6 H2S減輕腎臟I/R損傷

CBS是腎臟轉(zhuǎn)硫途徑中的限速酶，Xu Z等［36］通過研究SD大鼠左側(cè)腎臟I/R(45 min/6 h)模型發(fā)現(xiàn)，I/R導(dǎo)致了腎臟的脂質(zhì)過氧化和細胞死亡，CBS活性降低，H2S的生成減少，而另外一種H2S的生成酶CSE在腎臟中沒有明顯變化，給予NaHS(100 μg/kg)可明顯改善腎臟功能，上述研究表明在腎臟中保持一定的H2S水平可以減輕I/R損傷。

在小鼠雙側(cè)腎臟I/R(30 min/24 h)模型中，I/R后CSE表達明顯增高，H2S水平增高，在缺血前30 min和再灌注6 h給予NaHS(100 μmol/kg)，可改善I/R損傷造成的腎功能障礙，使血清中肌酐和尿素氮水平明顯降低［37］。在 Wistar大鼠雙側(cè)腎臟 I/R(45 min/72 h)模型中，CSE抑制劑PPG可抑制腎功能的恢復(fù)，血清中肌酐和尿素氮水平明顯增高。NaHS(100 μmol/kg)在腎臟缺血前15 min和再灌注前5 min 2次給予，在腎臟缺血45 min再灌注30 min時，NaHS可明顯降低絲裂原激酶的磷酸化(p38、c-JNK和ERK)和激活NF-κB，在再灌注6 h時，NaHS明顯減輕急性腎小管壞死，使抗凋亡蛋白Bcl-2增高，NF-κB依賴的相關(guān)蛋白降低(iNOS、COX-2和ICAM-1)，以上研究表明CSE在腎臟I/R后恢復(fù)功能拮抗損傷是必要的，NaHS可降低腎臟I/R損傷和功能障礙，其保護作用與抗凋亡和抗炎性反應(yīng)有關(guān)［17］。在豬的主動脈阻塞誘導(dǎo)的腎臟I/R損傷模型中，利用主動脈內(nèi)氣囊阻塞使腎臟缺血90 min然后再灌注8 h，Na2S使血液中IL-6、IL-1β和硝基硝酸鹽水平降低，同時降低iNOS 和 Bcl-xL 表達，使 NF-κB 激活增高［38］。

2.7 H2S減輕肌肉I/R損傷

在培養(yǎng)的小鼠骨骼肌細胞缺氧復(fù)氧模型中，發(fā)現(xiàn)給予10 μmol/L H2S其保護作用明顯。在小鼠下肢骨骼肌I/R(3 h/3 h)模型中，10 μmol/L H2S可明顯減輕I/R所致的細胞損傷，降低凋亡指數(shù)［39］。在體外培養(yǎng)的肌細胞中，H2S在缺氧1、3和5 h使凋亡指數(shù)分別降低75%(P=0.002)、80%(P=0.006)和83%(P＜0.001)。在小鼠下肢骨骼肌I/R模型中，H2S可明顯減輕損傷，降低細胞凋亡指數(shù)，在再灌注前20 min給予H2S可有明顯的細胞保護作用，但在缺血前1 min給予H2S不具有上述保護作用，以上研究表明H2S可減輕骨骼肌I/R損傷，H2S的劑量和給予時間是影響治療效果的因素［40］。

2.8 器官移植

H2S在各種缺氧和炎性反應(yīng)疾病中能誘導(dǎo)低代謝和血流動力學［41］，能減輕在體移植皮瓣的損傷，從而提高成活率［42］，通過NOS-3依賴的信號途徑改善心臟驟停后心臟復(fù)蘇的效果［25］。在無心跳供體豬腎臟移植研究［31］中發(fā)現(xiàn)，H2S能改善腎功能障礙相關(guān)的缺血損傷，改善腎臟供血，增高肌酐清除率，減輕氧化損傷［6］，能抑制休克誘導(dǎo)的代謝性酸中毒，降低iNOS的表達和NO的產(chǎn)生［43］。

3 H2S減輕I/R損傷的機制

3.1 ATP敏感性鉀 (ATP sensitive potassium，KATP)通道

Bian J S等［44］對離體心肌細胞 I/R(9 min/10 min)研究表明，在缺血前間斷3次給予NaHS(100 μmol/L，每次3 min)可明顯減輕I/R損傷作用，細胞活力增強，細胞內(nèi)鈣濃度降低，給予膜KATP通道特異性抑制劑HMR-1098和非選擇性KATP抑制劑格列本脲均能使NaHS對大鼠心肌I/R的保護作用消失，而給予線粒體KATP通道抑制劑 (5-HD，100 μmol/L)無上述作用，說明膜KATP通道在H2S減輕心肌I/R中發(fā)揮著重要的作用。然而，Johansen D等［15］在離體大鼠心臟I/R(30 min/120 min)模型研究［31］中發(fā)現(xiàn)，給予5-HD(100 μmol/L)可抑制NaHS(100 μmol/L)對心臟I/R的保護作用，Sivarajah A等［45］采用在體大鼠心臟I/R模型(25 min/120 min)研究發(fā)現(xiàn)，給予5-HD(5 mg/kg)可抑制NaHS的心肌保護作用，上述研究表明線粒體KATP也參與了NaHS的心肌保護作用，之所以研究結(jié)果略有不同可能與NaHS的給藥方式和動物模型不同有關(guān)。

3.2 減輕氧自由基損傷

Jha S等［13］研究表明在小鼠的肝臟I/R(60 min/5 h)模型中，H2S可減輕I/R損傷，降低血漿中升高的ALT和AST，使GSH/GSSG比值增高，上調(diào)細胞的抗氧化能力。另外H2S可減輕肺I/R損傷［14］，降低肺組織中MDA的生成，使抗氧化物質(zhì)SOD和CAT的活性增強，減少超氧陰離子產(chǎn)生，MDA是氧自由基攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸而形成的脂質(zhì)過氧化物，它能生成聚合物并與人體內(nèi)的蛋白質(zhì)和脫氧核糖核酸發(fā)生反應(yīng)，使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變異。研究［31］中發(fā)現(xiàn)H2S可以明顯減輕高同型半胱氨酸誘導(dǎo)的小鼠腦的氧化損傷，增強GSH、CAT和SOD的活性，減少氧自由基的生成。在培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)細胞中，H2S通過增高GSH的產(chǎn)生，而抑制線粒體中的氧化應(yīng)激［29］，上述研究表明H2S的細胞保護作用與抑制自由基的生成，增強細胞抗氧化能力有關(guān)

3.3 減少細胞凋亡

Hu Y 等［19］采用 H2S(1 ～100 μmol/L)預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)H2S增強了細胞活性，在預(yù)處理過程中使用ERK1/2或Akt的抑制劑可減弱H2S的心肌保護作用，蛋白免疫印記分析表明H2S預(yù)處理增強了ERK1/2或Akt磷酸化表達。Minamishima S等［25］采用離體成年大鼠心肌細胞缺氧6 h復(fù)氧12 h研究H2S對凋亡途徑的作用，發(fā)現(xiàn)NaHS減少了caspase-3的激活，降低了核碎裂DNA片段，說明抑制了心肌I/R損傷的凋亡。Sivarajah A等［24］發(fā)現(xiàn)大鼠局部心肌缺血增強了p38 MAPK和JNK1/2的磷酸化，在缺血前給予NaHS可明顯降低p38 MAPK和JNK1/2的磷酸化。另外，H2S對大鼠心肌I/R的保護作用與下調(diào)c-Fos蛋白的表達有關(guān)［46］，在小鼠心肌缺血45 min再灌注120 min后，心肌未裂解的caspase-3的表達減少，裂解的caspase-3活性增強，而給予Na2S后，有活性的裂解caspase-3明顯降低，說明Na2S抑制了I/R過程的凋亡途徑。熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)與細胞凋亡關(guān)系密切，其作用機制與HSP抑制應(yīng)激激活蛋白激酶、抑制凋亡基因P53和Bax的表達和氧自由基生成以及對細胞線粒體功能的保護作用有關(guān)［47］。在心肌I/R 研究［20，23］中發(fā)現(xiàn)，H2S 明顯增高 HSP90、HSP70 或HSP72蛋白表達，另外，研究［13］表明H2S明顯增高小鼠肝臟I/R后肝組織中HSP90的表達，上述研究表明H2S的抗凋亡作用與上調(diào)HSPs家族有關(guān)。另外，Yao L L等［48］研究表明，NaHS通過誘導(dǎo) GSK-3β 的磷酸化，然后抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，減少心肌細胞缺氧復(fù)氧所致的凋亡。

3.4 抑制炎性反應(yīng)

研究［24］表明在大鼠心臟 I/R后，心肌中炎性反應(yīng)因子ICAM-1和髓過氧化物酶水平明顯增高，NF-κB蛋白表達明顯增高，缺血前給予NaHS(3 mg/kg)后，ICAM-1和髓過氧化物酶水平明顯下降，NF-κB蛋白表達明顯降低，另外，研究［27］表明H2S可明顯降低豬I/R后心肌組織中相關(guān)炎性反應(yīng)因子(IL-6、IL-8和TNF-α)的水平，同時髓過氧化物酶水平明顯降低，在大鼠肝I/R中，H2S可降低血清中相關(guān)炎性反應(yīng)因子(NO、ICAM-1、IL-10 和 TNF-α)的水平［34］，上述研究表明H2S對I/R損傷的炎性反應(yīng)介質(zhì)具有明顯的抑制作用。環(huán)氧合酶(cyclcoxygenase，COX)是前列腺素合成過程中一個重要限速酶，分為結(jié)構(gòu)型(COX-1)和誘導(dǎo)型(COX-2)。COX-1主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，COX-2集中在核膜上，受炎性反應(yīng)信號、生長因子等刺激而增加［49］，COX-2通過促進氧自由基的生成、增加細胞內(nèi)鈣超載和降解細胞外基質(zhì)等加重I/R損傷［50］。研究［17-18，23］表明心肌 I/R 后，心肌組織中 COX-2 蛋白表達明顯降低，給予H2S可使I/R后心肌COX-2蛋白表達明顯增高，上述研究表明H2S對I/R損傷的炎性反應(yīng)具有明顯的抑制作用。

總之，H2S對器官I/R具有廣泛的保護作用，其機制與抑制自由基的形成、減少細胞凋亡、抑制炎性反應(yīng)和KATP通道等有關(guān)，探索H2S的機制及應(yīng)用方式具有重要的意義，可為臨床的藥物開發(fā)提供實驗基礎(chǔ)。

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