紫花苜蓿MsZIP基因超表達載體的構建及轉基因苜蓿檢測

李燕，孫彥，楊青川＊，康俊梅，張鐵軍，房鋒

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，北京100191；3.中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，北京100193）

＊隨著生物技術的發(fā)展，對于植物的研究已經(jīng)深入到分子水平，側重于從分子角度闡明植物各種生理反應機理，分子機制，以及基因水平的調控。在培育植物新品種，提高植物抗逆性方面，植物轉基因技術已經(jīng)成為近年來研究的重點內容之一。轉基因育種也成為了苜蓿新品種培育的一項重要手段［1］。在目前的植物轉基因育種中，主要采用的技術有農(nóng)桿菌介導法，微注射法，電擊法和基因槍法。在紫花苜蓿（Medicagosativa）的育種工作中，農(nóng)桿菌介導法成為主要的方法，1986年，首例農(nóng)桿菌介導的苜蓿轉化獲得成功，之后又建立了紫花苜蓿的遺傳轉化體系［2，3］，苜蓿轉基因工作獲得了很大的進展。在苜蓿中，已經(jīng)有很多抗逆相關的基因被分離，Brouwer等［4］將煙草（Nicotianatabacum）的Mn－SOD cDNA導入苜蓿中，發(fā)現(xiàn)轉基因植物SOD活性增強，2輪的田間試驗鑒定表明，轉基因苜蓿的抗寒性明顯提高。2000年Winicov和Bastold［5］將Alfinl基因導入苜蓿中，增強了鹽誘導的MsPRP2基因的表達，在植株的生長過程中其耐鹽性得到了提高，并且生長速度加快。Munnik等［6］從紫花苜蓿中分離出了MAPK（mitogen－activated protein kinase）路徑第一個關鍵酶基因SIMK，序列分析結果表明，它與擬南芥（Arabidopsisthaliana）中的MAPK基因具有極大的相似性，鹽脅迫下其體內的表達水平上調。2011年，江藤等［7］對蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）全基因組WRKY轉錄因子進行了分析，發(fā)現(xiàn)蒺藜苜蓿中含有28個WRKY基因，同時將這些基因與水稻（Oryzasativa）的WRKY基因進行了比較分析，為研究苜蓿的WRKY轉錄因子提供了重要的理論依據(jù)。劉曉靜等［8］將抗凍基因CBF2構建表達載體并轉化和田苜蓿，成功得到和田苜蓿的愈傷組織。燕麗萍等［9］采用分子生物學檢測和不同濃度的NaCl對轉BADH基因苜蓿T1代2個株系進行遺傳穩(wěn)定性和抗鹽性研究，結果表明，轉入的BADH基因可以穩(wěn)定遺傳，轉基因苜蓿耐鹽性明顯高于對照。蔣世翠等［10］將αFGF基因構建表達載體并轉化紫花苜蓿，成功得到了表達αFGF基因的苜蓿，為苜蓿作為植物生物反應器奠定了理論基礎。

紫花苜蓿是分布最廣的一種牧草，它的適應性很強，是世界上種植面積最廣的一種牧草。但是干旱脅迫和高鹽脅迫卻是影響苜蓿生長的主要因素，為了從分子機理上解決這一問題，越來越多的鹽誘導基因已經(jīng)從苜蓿中分離出來，在煙草中超表達可以增強煙草的耐鹽性［11，12］。Deutch和Winicov［13］從耐鹽苜蓿cDNA文庫篩選到一個新cDNA克隆，稱作MSPRP29基因，研究表明該基因與紫花苜蓿富含脯氨酸的細胞壁蛋白轉錄后鹽調節(jié)表達有關，能夠通過提高耐鹽苜蓿中的脯氨酸含量來提高苜蓿的耐鹽性。Borsics和Lados［14］用差異顯示法從菟絲子（Cuscutachinensis）侵染的紫花苜蓿中克隆出一個與鈣調蛋白相關的基因PPRGl，在高鹽、滲透、低溫以及ABA處理下，PPRGl轉錄水平快速上調。Ginzberg等［15］從鹽脅迫的紫花苜蓿根cDNA文庫中成功克隆出2個編碼Pro關鍵的合成酶基因cDNA克隆，MsP5CS－1和MsP5CS－2，兩者的轉錄水平在鹽脅迫下顯著增加。本實驗室從耐鹽苜蓿中克隆得到的鋅指蛋白基因MsZFN，在鹽誘導下，表達量也顯著升高［16］。

本試驗構建植物超表達載體PBI－MsZIP，并采用農(nóng)桿菌介導的方法將目的基因MsZIP轉入苜蓿中。成功獲得了轉基因苜蓿苗，其后的生理指標檢測表明，在苜蓿中超表達MsZIP基因，可以提高苜蓿的耐鹽性，為研究該基因的功能以及苜蓿新品種的選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

耐鹽品種紫花苜蓿中苜1號由中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所育成，本實驗室保存種子。本試驗于2011年進行。選取飽滿健康的種子用75%乙醇滅菌10 min，0.1%升汞滅菌7 min后，無菌水洗凈，放置在1／2 MS固體培養(yǎng)基上，于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

克隆載體PMD18－T，實驗所需的各種限制性內切酶和T4DNA連接酶購自Takara公司，用于構建超表達載體的原始質粒PBI121和農(nóng)桿菌菌株LBA4404由本實驗室保存。大腸桿菌感受態(tài)DH5α購自北京全式金生物技術公司。質粒小提試劑盒，膠回收試劑盒，Trizol購自北京博邁德生物公司。其他生化試劑均購自北京康博順達生物有限公司。

1.2 MsZIP編碼區(qū)cDNA的獲得

根據(jù)已經(jīng)得到的MsZIP基因序列，設計1對帶有酶切位點的引物：MF：5′－ATGGGGACTAAG－GAG－3′；MR：5′－TTCAAGGTTAGCAAC－3′。酶切位點用下劃線表示，分別為XbaI和BamHI。提取紫花苜蓿總RNA，反轉錄成c DNA作為模板，進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳分析后，切膠回收，連接到克隆載體PMD18－T上，命名為PMD－MsZIP，轉化大腸桿菌，挑取陽性單菌落，菌體PCR檢測之后，將含有目的條帶的陽性克隆送到北京華大基因生物技術有限公司測序。

1.3 超表達載體的構建

選取測序完全正確的陽性菌提取質粒，用限制性內切酶XbaI和BamHI雙酶切質粒PMD－MsZIP和PBI121，瓊脂糖凝膠檢測后各自回收目的片段，用T4DNA連接酶，16℃連接6 h。連接好的載體命名為PBIMsZIP，轉化大腸桿菌，挑取陽性單菌落，PCR檢測后送陽性克隆測序。將含有陽性克隆的菌落，提取質粒，XbaI和Bam HI雙酶切鑒定。

1.4 轉基因苜蓿的獲得

將構建好的超表達載體采用CaCl2凍融法轉入農(nóng)桿菌中，用于苜蓿的轉化。苜蓿種子滅菌后播種在無菌1／2MS培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，切下子葉，轉入預培養(yǎng)培養(yǎng)基（2，4－D 2.0 mg／L＋KT 0.25 mg／L＋UM）中培養(yǎng)2 d后，將子葉浸泡在OD600＝0.5的農(nóng)桿菌轉化菌液中10 min。取出后吸干菌液，擺放在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上（2，4－D 2.0 mg／L＋KT 0.25 mg／L＋UM），黑暗培養(yǎng)48 h。之后轉入誘芽培養(yǎng)基（50 mg／L Kan＋300 mg／L Cef＋2.0 mg／L 2，4－D＋KT 0.25 mg／L＋UM），直至形成愈傷組織，出現(xiàn)再生芽。當再生芽長至1 cm左右時，將芽切下，轉入1／2MS培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)。當再生苜蓿苗根長至10 cm，地上部分長至10 cm左右時，轉入營養(yǎng)土中，溫室中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 再生植株的檢測

設計1對載體 PBI－MsZIP 上的引物 NPT1：5′－ATACCGTAAAGCACGAGGAAG－3′和 NPT2：5′－CTGAAGCGGGAAGGGACT－3′，用于擴增卡那霉素抗性基因NPTⅡ。實驗室改進的CTAB法［17］提取轉基因抗性苜蓿苗的基因組DNA作模板，質粒PBI121和未轉基因苜蓿DNA分別作為陽性和陰性對照，進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳分析。

以MF和MR為引物，用于擴增目的基因。Trizol法提取轉基因抗性苜蓿苗的總RNA（參見說明書），反轉錄產(chǎn)物作為模板，質粒PBI－MsZIP和PBI121分別為陽性對照和陰性對照，進行RT－PCR擴增。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳分析。

分別用200 mmol／L NaCl和25μmol／L PEG－6000處理轉基因苜蓿，3 d后測量可溶性蛋白含量，可溶性糖含量，相對含水量，丙二醛含量以及脯氨酸含量［18］。每個樣品都做3次重復，測量結果用SAS 9.0數(shù)據(jù)分析軟件在P＜0.05水平進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 MsZIP基因c DNA序列的獲得

以紫花苜?？俁NA反轉錄得到的cDNA為模板，MF和MR為引物，進行PCR擴增。得到1條長約1 000 bp的條帶（圖1）。將PCR產(chǎn)物切膠回收后，連接到載體PMD18－T上，轉化大腸桿菌，將PCR鑒定的陽性克隆測序，結果表明序列正確無誤，沒有堿基突變和移碼突變，成功的克隆得到MsZIP基因。

2.2 超表達載體PBI－MsZIP構建

提取構建好的質粒PBI－MsZIP，用限制性內切酶XbaI和BamHI雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳得到1條約1 000 bp的條帶（圖2），與預期大小相符，表明植物超表達載體PBI－MsZIP構建成功。

圖1 MsZIP編碼區(qū)cDNA的克隆Fig.1 Cloning of coding region of MsZIP

圖2 超表達載體的酶切鑒定Fig.2 Identification of over expressed vectors

2.3 紫花苜蓿再生植株轉化

經(jīng)過農(nóng)桿菌轉化的苜蓿子葉，在誘芽培養(yǎng)基上生長30 d后，形成愈傷組織（圖3A），繼續(xù)培養(yǎng)60 d之后，可見在愈傷組織上出現(xiàn)綠色的出芽點，開始形成再生芽（圖3B），當再生芽長到1 cm左右時，將再生芽切下，轉入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)（圖3C），再生植株成苗后，根長10 cm，地上部分10 cm左右時（圖3D），即可轉入營養(yǎng)土中，在溫室中繼續(xù)培養(yǎng)（圖3E）。

2.4 再生植株PCR鑒定

從獲得的11株抗性植株中，選取4株進行卡那霉素抗性基因的鑒定。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳上分析這幾株再生苗均得到長為400 bp左右的條帶（圖4），與目的大小一致。同時對這4株抗性苗進行目的基因的RT－PCR檢測，1%瓊脂糖凝膠電泳結果表明，得到了約為1 000 bp的條帶（圖5），與目的大小一致。證明這4株轉基因苜蓿轉化成功。

圖3 苜蓿轉基因苗的再生Fig.3 Alfalfa regeneration plants

圖4 再生植株卡那霉素抗性基因檢測Fig.4 NPTⅡgene testing of regeneration plants

圖5 再生植株MsZIP目的基因檢測Fig.5 MsZIP gene testing of regeneration plants

2.5 再生植株生理指標測定

在干旱和高鹽處理之后，可溶性糖含量均增加，轉基因苜蓿中高于未轉基苜蓿，干旱處理后的增加量高于鹽處理（圖6A）；可溶性蛋白的含量也有所增加（圖6B）；相對含水量測定結果顯示，高鹽處理之后，轉基因苜蓿和未轉基因苜蓿的差異不大，干旱處理之后，轉基因苜蓿中的相對含水量要高于未轉基因苜蓿（圖6C）；丙二醛含量均有顯著的增加，轉基因苜蓿的增幅小于未轉基因苜蓿，干旱處理之后丙二醛的增加量大于高鹽處理（圖6D）；在轉基因和未轉基因苜蓿中脯氨酸的含量均大幅增加，轉基因苜蓿的增幅大于未轉基因苜蓿，高鹽處理之后的增幅大于干旱處理（圖6E）。

3 討論

圖6 再生植株逆境脅迫下生理指標的測定Fig.6 Physiological parameter testing of regeneration plants

堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）蛋白是真核生物的轉錄因子和阻抑蛋白中最大而且最保守的類型之一［18］。b ZIP包含2個主要的結構域：一個DNA序列特異性結合的結構域和亮氨酸拉鏈區(qū)，該區(qū)域每7個相鄰的氨基酸的第7位含有一個亮氨酸［19］。目前，對于植物中bZIP蛋白已經(jīng)有了大量的研究，擬南芥［20］，大麥（Hordeumvulgare）［21］，水稻［22］，煙草［23］，玉米（Zeamays）［24］和刀豆（Canavaliagladiata）［25］中的bZIP基因都已經(jīng)被克隆并進行了初步分析，bZIP轉錄因子主要參與了植物的花發(fā)育，ABA誘導，耐旱，耐鹽等生理過程。但是在紫花苜蓿中還沒有研究，為了解紫花苜蓿中的MsZIP基因在苜蓿的生長過程中所發(fā)揮的作用，本實驗室首次克隆并初步分析MsZIP基因的功能。

在逆境脅迫下，植物體由于大量失水會產(chǎn)生滲透脅迫，使植物的物質代謝發(fā)生改變，一些滲透調節(jié)物質相繼生成并積累，一些大分子物質（淀粉，蛋白質）分解成小分子物質（糖，氨基酸）。這些小分子物質具有較強的親水性，可以穩(wěn)定膠體性質，在組織代謝中，使植物細胞免受傷害或傷害減輕。因此植物細胞的滲透調節(jié)作用是植物適應環(huán)境，提高抗性的基礎［26］。可溶性糖和脯氨酸是植物體內重要的滲透調節(jié)物質，在干旱、低溫、高溫、鹽漬等逆境下都會造成植物體內可溶性糖和脯氨酸含量的增加，這是植物對逆境脅迫的一種生理生化反應。本實驗測定轉基因苜蓿中的可溶性糖和脯氨酸含量均顯著增加，從而可以起到滲透調節(jié)作用，增強植物的耐鹽和抗旱性［27，28］。

在植物細胞中，存在許多非生物脅迫可以誘導活性氧大量產(chǎn)生從而導致脂質過氧化［29］。MDA是生物膜上的游離自由基連鎖反應和脂質過氧化作用的終產(chǎn)物，MDA的含量能夠反應脂質過氧化作用和膜受傷害的程度。因此，測定逆境脅迫下MDA的含量是評價植物適應逆境條件的一個重要指標。MDA增幅越大，受到的傷害越大，本實驗中，相對于未轉基因的苜蓿而言，在脅迫處理之后，轉基因苜蓿的丙二醛含量增幅要小，這也正說明轉基因苜蓿的抗逆性提高。

蛋白質合成對植物的鹽脅迫很敏感［30，31］，特別是蛋白質的翻譯可以顯著的被鹽誘導抑制。此外，在鹽脅迫下，可溶性蛋白的含量也會發(fā)生變化。在耐鹽性品種的大麥，向日葵（Helianthusannuus），水稻［32］和豇豆（Vignaunguiculata）［33］中，鹽脅迫下可溶性蛋白的含量顯著增加。因此，鹽脅迫下植物可溶性蛋白含量的測定可以作為評價植物耐鹽性的一個重要指標。本實驗中，在鹽脅迫和干旱脅迫下，植物的可溶性蛋白質含量顯著增加，說明轉基因苜蓿的耐鹽和耐旱性都有提高?？傊ㄟ^這些生理指標的測定表明MsZIP基因在苜蓿中的超表達可以顯著提高苜蓿的耐鹽性和耐旱性，為深入研究MsZIP基因的功能和苜蓿的遺傳育種工作，以及今后將該基因在其他作物和牧草中表達，開展抗逆基因工程奠定基礎。

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