宮頸癌中Survivin mRNA的表達(dá)及其臨床價值

湖北省武漢市第五醫(yī)院婦科

黃 玲 鄧梅先 宋 芳 劉敏娟 沈漢斌

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個涉及到多基因的分子水平變化的多階段過程。近年分子生物研究表明，宮頸癌為多基因、遺傳、環(huán)境等致癌因素等誘導(dǎo)下綜合作用的結(jié)果，細(xì)胞凋亡在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。survivin也稱生存素或生存蛋白，是凋亡抑制蛋白家族（IAP）的成員，在體外能夠直接抑制細(xì)胞凋亡下游效應(yīng)器caspase的活性，具有強大的抗凋亡作用[1,2]。在此我們運用RTPCR方法對22例宮頸癌及其癌旁組織，以在mRNA水平評價survivin基因表達(dá)及其變化，了解其與新輔助化療療效之間的相關(guān)性，為新輔助化療尋找有效的預(yù)測因子。

1 資料與方法

1.1 病例及分組 宮頸癌組：選取2003～2009年間我院收療的宮頸癌組織22例，病理診斷均為宮頸癌。年齡29～59歲，平均年齡37.2歲。22例宮頸癌中腺癌4例，鱗癌18例。臨床病理分期為：Ⅰb期12例，Ⅱa期8例，Ⅱb期2例。癌旁組織組：標(biāo)本取自上述22例病例距腫瘤2cm以遠(yuǎn)的組織，經(jīng)病理檢查均無癌。所有樣品取出后均凍存于-70℃待檢。

1.2 化療方案 所有患者接受PVB或PF方案的新輔助化療方案，10天為1個周期，共進(jìn)行2個療程。在接受新輔助化療前接受臨床觸診估測及超聲檢測，每周期化療結(jié)束后重新測量腫瘤大小，全部化療結(jié)束后再檢測。腫瘤對化療的臨床評價根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)[3]，腫瘤對化療反應(yīng)的組織學(xué)評價根據(jù)Ogston的分級方法[4]。

1.3 Survivin mRNA檢測 Trizol試劑購自Gibco公司。MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA抑制物為Promega公司產(chǎn)品。DNA聚合酶購自日本Takara公司。兔抗人survivin多克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品。辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購自北京中山生物工程公司。

取凍存組織50～100mg，加入1ml Trizol（Gibco公司）充分勻漿，按照二步法提取組織中的總RNA。取少量樣本測定RNA的濃度（計算濃度公式為：樣品的A260值×40×稀釋倍數(shù)，單位是μg/ml）和純度（樣品的A260/A280比值），紫外分光光度儀A260nm/A280nm讀數(shù)在1.8～2.0之間方繼續(xù)試驗。

應(yīng)用20μl反應(yīng)體系，每管中加入模板RNA1μg，oligo（dT）50pmol，5×PCR反應(yīng)緩沖液4μl，dNTP混合物（10mmol/L）2μl，R Nase Inhibitor20U，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶10U，加DEPC處理的水至20μl?；旌虾?500r/min離心2min，室溫放置10min后轉(zhuǎn)入42℃反應(yīng)1h，99℃5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶活性，冰水中冷卻2min，完成cDNA合成。人類survivin的PCR引物為5′-CTCAAGGACCACCGCATCTC-3′和5′-CCTCAATCCATGGCAGCCAG-3′，合成產(chǎn)物為392bp，合成產(chǎn)物247 bpβ-actin作為內(nèi)參照。所有引物由上海生工生物工程公司合成。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件分析。根據(jù)數(shù)據(jù)性質(zhì)采用χ2檢驗。P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ssurvivin mRNA表達(dá) 宮頸癌組標(biāo)本中Survivin mRNA陽性率為77.3％（17/22），而癌旁組織組表達(dá)陰性。而β-actin在宮頸癌組織和對照的癌旁組織中的表達(dá)強度基本一致（見圖1）。

2.2 新輔助化療的效果 22例患者經(jīng)過新輔助化療后，有1例獲得臨床完全緩解（cCR），占4.5％（1/22）；12例獲得臨床部分緩解（PR），占54.5％（12/22）；9例獲得臨床穩(wěn)定（SD），占40.9％（9/22），無1例發(fā)生疾病進(jìn)展（PD）。

2.3 Ssurvivin mRNA在宮頸癌患者各特征性因素中的表達(dá) Survivin mRNA表達(dá)陽性在37.2歲以下為10/12（83.3％），37.2歲以上為7/10（70.0％）；病理分型：腺癌為4/4（100.0％），鱗癌為13/18（72.2％）；腫瘤分期：Ⅰb為9/12（75.0％），Ⅱa期為6/8（75.0％），Ⅱb期為2/2（100.0％）；Survivin mRNA的表達(dá)與患者的年齡、病理分型、分期均無關(guān)（P＞0.05）；Survivin mRNA表達(dá)陽性在新輔助化療后完全緩解（cCR）的患者中為0/1（0.0％）、獲得臨床部分緩解（PR）的患者為8/12（66.7％）和獲得臨床穩(wěn)定（SD）的患者為9/9（100.0％），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

宮頸癌是發(fā)病率和病死率僅次于乳腺癌的最常見的女性惡性腫瘤。近40年來隨著宮頸癌篩查的普及開展，其發(fā)病率及病死率已明顯下降，但有年輕化趨勢，關(guān)于這種趨勢的原因和特點已引起國內(nèi)外的廣泛關(guān)注[5]。宮頸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜過程，涉及到血管、淋巴管新生、細(xì)胞外基質(zhì)降解和細(xì)胞凋亡調(diào)控等很多因素。

注：L1為宮頸癌擴增電泳結(jié)果（392bp）；L2為宮頸癌旁組織電泳結(jié)果

近年研究發(fā)現(xiàn)，凋亡抑制蛋白（Inhibitors of apoptosis proteins，IAPs）家族在細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用[6]，凋亡不僅在正常生理調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，在惡性病變過程中也起著重要作用。細(xì)胞凋亡過程受凋亡抑制基因與凋亡活化基因的共同調(diào)節(jié)[7,8]。survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，是IAP家族中最小的成員，它由定位在人染色體17q25位點的單拷貝基因編碼，是含有142個氨基酸、相對分子質(zhì)量為16 500的蛋白，具有抑制凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的作用[7]。survivin其結(jié)構(gòu)獨特，僅含有一個桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復(fù)序列（BIR）分子，作用于各種凋亡通路末端效應(yīng)分子，是迄今發(fā)現(xiàn)最強的凋亡抑制因子之一。實驗研究證實[9]，survivin能抑制Fas、caspase、bax及某些化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。survivin的組織分布特征具有明顯的細(xì)胞選擇性，在正常成人組織中幾乎未檢測到survivin基因的表達(dá)[10]。而在大多數(shù)腫瘤組織內(nèi)有survivin的表達(dá)，這種重新表達(dá)的機制目前尚不明確[11]。survivin具有周期依賴性表達(dá)及抗凋亡作用。

Kim等[12]采用免疫組化方法檢測了4l例宮頸內(nèi)皮瘤和宮頸鱗狀細(xì)胞癌，結(jié)果顯示survivin在低度鱗狀上皮內(nèi)瘤樣病變、高度鱗狀上皮內(nèi)瘤樣病變及SCC中的陽性表達(dá)率分別是66.7％、87.5％和100％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明sruvivi陽性表達(dá)與宮頸腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)。本研究對宮頸癌組織Survivin mRNA表達(dá)測定發(fā)現(xiàn)，宮頸癌細(xì)胞高表達(dá)Survivin mRNA，本組陽性率為77.3％。腫瘤細(xì)胞Survivin mRNA表達(dá)水平較正常宮頸組織明顯增高，表明其與宮頸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能是參與抑制惡性瘤細(xì)胞的凋亡過程中的關(guān)鍵因素。Survivin mRNA表達(dá)與臨床特征相關(guān)性的分析顯示，腫瘤內(nèi)Survivin mRNA的表達(dá)與宿主年齡、病理分型、分期均無關(guān)。

研究顯示，survivin與宮頸癌的形成和發(fā)展有著密切的關(guān)系[13]，其過度表達(dá)可克服凋亡的關(guān)卡，通過有絲分裂促進(jìn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的異常增殖；survivin的過表達(dá)可能與化療藥物的耐藥性相關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌化療Survivin mRNA的表達(dá)水平與新輔助化療療效存在相關(guān)性，即新輔助化療后獲得臨床穩(wěn)定（SD）的患者、獲得臨床部分緩解（PR）和完全緩解（cCR）的患者相比，后者的化療療效好于前者。本研究結(jié)果顯示了Survivin mRNA的表達(dá)陽性的化療療效效果差也可能與順鉑耐藥相關(guān)。

通過對宮頸鱗癌組織及癌旁組織中Survivin mRNA表達(dá)的研究，提示宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)異常及細(xì)胞增殖活性增加有關(guān)。Survivin mRNA的異常表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，可以作為宮頸癌新輔助化療療效的手段之一。Survivin mRNA在宮頸癌組織中的異常表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡減少，對宮頸癌的發(fā)生起到重要作用，可為臨床篩查宮頸癌及判斷預(yù)后提供新的依據(jù)和診斷指標(biāo)。

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