類蛋白反應(yīng)在蛋白水解物風(fēng)味改善中的研究進(jìn)展

王 朋，何鍵東，羅紅宇

（浙江海洋學(xué)院 食品與藥學(xué)學(xué)院、醫(yī)學(xué)院，浙江 舟山 316000）

類蛋白反應(yīng)在蛋白水解物風(fēng)味改善中的研究進(jìn)展

王 朋，何鍵東，羅紅宇*

（浙江海洋學(xué)院 食品與藥學(xué)學(xué)院、醫(yī)學(xué)院，浙江 舟山 316000）

蛋白質(zhì)在酶解過程中，大量疏水性氨基酸殘基暴露出來，產(chǎn)生濃重的苦味影響到蛋白質(zhì)的風(fēng)味.在酶的作用下，疏水性氨基酸殘基經(jīng)過類蛋白反應(yīng)后數(shù)量降低，達(dá)到風(fēng)味改善的效果.類蛋白反應(yīng)與物化法改善蛋白水解液相比，具有無添加、無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊.

疏水性氨基酸殘基；類蛋白反應(yīng)；風(fēng)味改善

0 引言

蛋白質(zhì)是人體生長發(fā)育、保持生命正?；顒颖夭豢缮俚奈镔|(zhì)之一，大量研究表明，以數(shù)個(gè)氨基酸結(jié)合生成的低肽比氨基酸有更好的消化吸收性能，且營養(yǎng)和生理效果更為優(yōu)越.因此在營養(yǎng)不良或消化吸收有問題的特定人群的食品配方中，寡肽（由2～10個(gè)氨基酸組成）或蛋白質(zhì)水解物已經(jīng)逐漸取代氨基酸作為氮源的應(yīng)用.不僅如此，其中許多肽還具有原蛋白質(zhì)或其組成氨基酸所沒有的新功能，這些生物活性肽都以非活性狀態(tài)存在于蛋白質(zhì)長鏈中，當(dāng)用適當(dāng)?shù)牡鞍酌杆鈺r(shí)，它們的活性就被釋放出來.用蛋白酶水解法制得的活性肽具有較高營養(yǎng)價(jià)值和良好理化性質(zhì)，但多有苦味，在食品中的應(yīng)用受到限制.因此除去或者降低肽類產(chǎn)品苦味，以改善其食用價(jià)值，成為食品、醫(yī)藥和生物行業(yè)的一大重要研究課題[1].

1 蛋白酶解液苦味產(chǎn)生的原因及影響因素

1.1 苦味產(chǎn)生的原因

研究表明，苦味產(chǎn)生的主要原因在于酶解液中的疏水性氨基酸.在完整的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中，疏水性氨基酸通常隱藏在蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，不與味蕾直接接觸，因而感覺不到苦味存在.但是隨著水解的進(jìn)行，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，肽鏈斷裂，疏水性氨基酸殘基逐漸暴露，而使酶解液呈現(xiàn)苦味，蛋白質(zhì)的水解度越高、肽鏈斷裂越多，疏水性氨基酸殘基數(shù)量也就越多，苦味也就越濃.

1.2 影響因素

蛋白酶解液苦味強(qiáng)度主要受疏水性氨基酸含量、多肽相對分子質(zhì)量以及酶種的影響.首先，疏水氨基酸的含量、序列及所處的位置、空間結(jié)構(gòu)對苦味的產(chǎn)生有直接的影響，肽的苦味隨著疏水氨基酸含量的增加而加重.已有研究表明：合成的多肽中含有苯丙氨酸或酪氨酸殘基時(shí)，苦味明顯，且當(dāng)苯丙氨酸殘基處于C末端，以及肽中苯丙氨酸或者酪氨酸含量增加時(shí)，都會使得苦味變得更加強(qiáng)烈[2]；在同分異構(gòu)體中，C末端為L-苯丙氨酸時(shí)會比D-苯丙氨酸苦味強(qiáng)，如用D-苯丙氨酸取代六肽中的L-苯丙氨酸，會使得六肽呈現(xiàn)苦味加強(qiáng)[2].其次，氨基酸數(shù)目（或肽鏈的長度）也影響肽的苦味，苦味肽的鏈長兩三個(gè)氨基酸到幾十個(gè)氨基酸不等.可以通過Q法則（Q=ΣΔf/n，Δf為一個(gè)氨基酸殘基的疏水性，n為氨基酸殘基數(shù)量）判定不同相對分子質(zhì)量的肽是否具有苦味，該法指出肽的苦味與肽的平均疏水性相關(guān)，對于相對分子質(zhì)量小于6 000的肽，Q值小于1 300，沒有苦味，而當(dāng)Q值大于1 400時(shí)，會有苦味出現(xiàn)，對于超過6 000的肽，即使Q值大于1 400，也不會出現(xiàn)苦味，但是Q值無法判斷苦味強(qiáng)弱[3].再次，酶種和苦味的產(chǎn)生也有一定的聯(lián)系，研究表明，在苦味強(qiáng)度上，內(nèi)切酶效果要強(qiáng)于外切酶效果[4].由于內(nèi)切酶和外切酶在肽鏈上作用點(diǎn)不同，內(nèi)切酶從肽鏈內(nèi)部進(jìn)行特異性切割，相比外切酶，更易使疏水性氨基酸殘基暴露.此外水解物中總固形物含量對苦味強(qiáng)度也有影響，David Spellman等[5]報(bào)道，在相同水解度條件下，總固形物含量為300 g TS/l，其平均苦味值為25.4%，而總固形物含量為50 g TS/l時(shí)，平均苦味值為39.9%.

2 類蛋白反應(yīng)的研究概況

類蛋白反應(yīng)，又稱為合成類蛋白反應(yīng)或塑蛋白反應(yīng)，是指在一定條件下，通過蛋白酶的催化將高濃度蛋白質(zhì)水解物與蛋白酶一起保溫，生成一種膠狀蛋白類物質(zhì)的反應(yīng)[6].類蛋白反應(yīng)主要分成3個(gè)階段：蛋白酶解液的制備、酶解液的濃縮以及類蛋白合成.早在1901年就有關(guān)于酶催化合成蛋白質(zhì)的報(bào)道，在20世紀(jì)30年代，研究人員發(fā)現(xiàn)生物合成蛋白質(zhì)的過程中伴隨著酶促反應(yīng)的逆過程，到了20世紀(jì)70年代，酶催化合成蛋白質(zhì)成為熱門研究領(lǐng)域[7].類蛋白反應(yīng)改善了蛋白質(zhì)的風(fēng)味，提高了生物蛋白的性價(jià)比.

2.1 類蛋白反應(yīng)的脫苦機(jī)理

盡管類蛋白反應(yīng)已經(jīng)有上百年的歷史，但是對于其反應(yīng)機(jī)制仍然存在很大的爭議，早期的觀點(diǎn)認(rèn)為類蛋白反應(yīng)是簡單動力學(xué)驅(qū)使的蛋白水解的逆反應(yīng).后期經(jīng)過證明類蛋白反應(yīng)的產(chǎn)物是一種新的蛋白質(zhì)，而不單純是蛋白水解的逆反應(yīng).目前關(guān)于類蛋白反應(yīng)的機(jī)理主要有以下幾種.

2.1.1 轉(zhuǎn)肽作用和縮合作用

轉(zhuǎn)肽作用（Transpeptidation Reaction）是指肽的氨基酸殘基或者酰胺基和其他肽的氨基酸殘基或者酰胺基進(jìn)行交換轉(zhuǎn)移.在酶法制備類蛋白試驗(yàn)中，利用過氧化苯甲酰-l-亮氨酸作為底物，加入木瓜蛋白酶和甘氨酸酰苯胺，甘氨酸殘基游離出來，并且生成了過氧化苯甲酰-l-亮氨酸酰苯胺，證實(shí)了轉(zhuǎn)肽作用的存在[8].在試驗(yàn)中使用兩種不同的二肽作為底物，在蛋白酶的作用下，形成了一種新的二肽[9]，在胃蛋白酶催化下的蛋白合成反應(yīng)中，通過轉(zhuǎn)肽作用，生成了一些聚合產(chǎn)物，其中包括了一些新合成的寡肽[10].在類蛋白反應(yīng)過程中，大小不同的相對分子質(zhì)量的肽都有一定程度的增加[11].

縮合反應(yīng)（Condensation reaction）是蛋白水解反應(yīng)的逆反應(yīng)，酶與濃縮液中短肽的羧基反應(yīng)脫去水，后與其他短肽反應(yīng)生成新的蛋白[12].Yamashita等[13]報(bào)道將大豆球蛋白作為底物和α-胰凝乳蛋白酶混合物濃縮至50%，利用18O標(biāo)記羧基，這些18O最后出現(xiàn)在水中，證實(shí)了此過程中縮合反應(yīng)起了主導(dǎo)作用.研究表明，在濃度較高時(shí)，類蛋白反應(yīng)主要依賴于縮合反應(yīng)，而在較低濃度時(shí)，轉(zhuǎn)肽作用明顯強(qiáng)于縮合作用.

2.1.2 疏水作用

在類蛋白反應(yīng)中，疏水作用是關(guān)鍵因素之一，酶解產(chǎn)物在疏水作用下以非共價(jià)鍵形式結(jié)合在一起，生成不溶性蛋白質(zhì)膠體即類蛋白，這種水介質(zhì)中的球狀蛋白質(zhì)分子的折疊總是傾向于把疏水殘基埋藏在分子內(nèi)部，從而降低酶解物的苦味，疏水性越強(qiáng)越有利于類蛋白反應(yīng)的進(jìn)行.Edwards等[14]利用α-胰乳蛋白酶和木瓜蛋白酶處理的雞蛋清作為底物合成類蛋白，并用SDS凝膠電泳對類蛋白產(chǎn)物進(jìn)行分析，沒有發(fā)現(xiàn)高分子，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物量產(chǎn)物，證實(shí)非共價(jià)鍵在合成類蛋白過程中起作用.Julio等[15]在測定肽鏈長度時(shí)，在pH4.7，溫度 37℃條件下，利用木瓜蛋白酶催化14C標(biāo)記的蛋氨酸乙酯與胃蛋白酶消化的大豆蛋白酶解液合成類蛋白，通過對14C原子的追蹤，發(fā)現(xiàn)不論底物和產(chǎn)物，肽鏈中均含有6個(gè)氨基酸殘基，試驗(yàn)期間并無高相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)產(chǎn)生，表明在該過程中共價(jià)鍵起到的作用很小.

2.2 合成類蛋白反應(yīng)的控制條件

2.2.1 底物濃度和酶種對合成類蛋白反應(yīng)的影響

合成類蛋白反應(yīng)中，底物濃度以及酶種對合成類蛋白反應(yīng)效率和產(chǎn)量有著重要的影響.底物濃度越高，可以有效降低肽鏈合成中對自由能的需求，從而有利于合成反應(yīng)，提高類蛋白的產(chǎn)量[16]；當(dāng)?shù)孜餄舛刃∮?%，此時(shí)水解反應(yīng)占主導(dǎo)地位，而水解反應(yīng)與類蛋白反應(yīng)的臨界點(diǎn)介于6%～8%之間，底物濃度在11%～43%時(shí)，類蛋白合成量有一個(gè)線性增加的過程[17].當(dāng)?shù)孜餄舛冉橛?0%～40%時(shí)，類蛋白產(chǎn)量能達(dá)到最大值[18].

在類蛋白合成反應(yīng)中，酶種的選擇也起著重要的作用，Williams等[17]研究了不同酶種對類蛋白反應(yīng)的影響，以類蛋白產(chǎn)量作為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)在pH5.0，底物濃度1%時(shí)，胃蛋白酶合成的類蛋白產(chǎn)率為13.0%，效果要明顯優(yōu)于木瓜蛋白酶（10.0%）、胰蛋白酶（12.6%）和胰凝乳蛋白酶（10.4%）.同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，水解和類蛋白反應(yīng)采用同種酶時(shí)，其合成活性越高，類蛋白產(chǎn)量也越高.崔鐵軍[18]報(bào)道，利用魚蛋白合成類蛋白，在相同底物濃度（40%）、相同溫度（37℃）、pH=5的條件下，胃蛋白酶合成類蛋白的含量高達(dá)33.12%，優(yōu)于胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶（pH=7）.常用的酶種主要以胃蛋白酶，胰蛋白酶，木瓜蛋白酶等內(nèi)切蛋白酶為主[19].

2.2.2 起始pH對合成類蛋白反應(yīng)的影響

大部分蛋白質(zhì)、寡肽和多肽的等電點(diǎn)集中在4.0～7.0之間，因此，當(dāng)反應(yīng)體系的pH介于4.0～7.0之間，體系生成的凝膠，便于類蛋白的合成[20-23].不同的酶在類蛋白合成過程中，對初始pH要求不同，Yamashita等[24]在其研究中定義ΔpH，即最適合成pH與最適酶解pH的差值，根據(jù)ΔpH值的大小將合成類蛋白反應(yīng)劃分為3種類型.當(dāng)ΔpH＞0時(shí)，胃蛋白酶型；ΔpH=0時(shí)，木瓜蛋白酶型；ΔpH＜0，胰凝乳蛋白酶型，胰蛋白酶除外.

2.2.3 溫度對合成類蛋白反應(yīng)的影響

類蛋白反應(yīng)和蛋白酶解一樣，均為酶促反應(yīng)，在這個(gè)過程中，溫度對酶的活性有較大影響，進(jìn)而影響到反應(yīng).在一定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，類蛋白含量會呈一個(gè)上升趨勢，當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，類蛋白含量不再繼續(xù)增加.朱曉杰等[25]利用海地瓜酶解物進(jìn)行類蛋白修飾時(shí)發(fā)現(xiàn)，45℃條件下，游離氨基酸含量減少最快，此時(shí)類蛋白產(chǎn)量達(dá)到最大；Williams等[17]分別在20℃、37℃、50℃和65℃條件下進(jìn)行類蛋白反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在 37～50℃之間類蛋白產(chǎn)量較高，65℃條件下，3 h內(nèi)類蛋白含量能達(dá)到93%，6 h后類蛋白含量不再增加，但是由于溫度過高時(shí)，蛋白容易變性，因此合成類蛋白的最佳溫度為37～50℃.

2.2.4 底物相對分子質(zhì)量對合成類蛋白反應(yīng)的影響

底物的相對分子質(zhì)量也對合成類蛋白有著很重要的影響，大多認(rèn)為低相對分子質(zhì)量短肽是合成類蛋白反應(yīng)的最佳底物[2,26-27]，一般合成類蛋白最有效的底物平均相對分子質(zhì)量介于685～1 043之間，肽鏈中含有5～6個(gè)氨基酸殘基，當(dāng)相對分子質(zhì)量低于或者高于該范圍時(shí)，合成效果不理想[22,26].利用玉米醇溶液合成類蛋白過程中，發(fā)現(xiàn)含有4～6個(gè)氨基酸殘基的短肽作為底物更適合制備類蛋白；用不同鏈長的肽合成類蛋白時(shí)，最適宜肽鏈應(yīng)包含5～6個(gè)氨基酸殘基；將大豆蛋白水解物按相對分子質(zhì)量劃分為4段，分別在pH6.5，底物濃度35%條件下合成類蛋白，發(fā)現(xiàn)第2段（平均相對分子質(zhì)量為1 043）和第 3段（平均相對分子質(zhì)量為 685）要比小于685和大于1 043的合成效果更好[28].

2.2.5 其他因素對合成類蛋白反應(yīng)的影響

張雅麗等[29]在利用大豆蛋白和芝麻蛋白合成類蛋白質(zhì)的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，水解度在40%、50%時(shí)，無類蛋白生成，并且出現(xiàn)了微量的水解反應(yīng)，隨著水解度的提高，類蛋白合含量也隨之提高，當(dāng)水解度達(dá)到80%，類蛋白含量達(dá)到最大量，水解度繼續(xù)提高時(shí)，類蛋白含量開始下降.另外，不同原料來源的水解蛋白，即使以適宜合成類蛋白反應(yīng)的形式參與反應(yīng)，其產(chǎn)物產(chǎn)量也存在很大的差別，如以胃蛋白酶為催化劑，以大豆蛋白的胰蛋白酶水解物和芝麻蛋白的胰凝乳蛋白酶水解物為底物，合成類蛋白反應(yīng)的產(chǎn)物產(chǎn)率高；而采用菌類蛋白在最適條件下合成類蛋白反應(yīng)的產(chǎn)率較低[11].

2.3 類蛋白在蛋白水解物風(fēng)味改善中的應(yīng)用

蛋白水解物常用的脫苦方法有物理、化學(xué)以及酶法等.物化方法在脫苦過程中常常會帶來一定的有害物質(zhì)，不宜應(yīng)用于食品、醫(yī)藥行業(yè)，而類蛋白反應(yīng)無化學(xué)物質(zhì)添加，無毒副作用，是一種良好的脫苦方法，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義.研究人員已經(jīng)利用植物蛋白[30-31]、動物蛋白以及微生物蛋白水解產(chǎn)物作為底物合成類蛋白[17,32-33]，同時(shí)他們發(fā)現(xiàn)，類蛋白反應(yīng)能有效改善蛋白酶解液的腥苦味問題，提高了蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值并改善了蛋白質(zhì)的功能特性.由于類蛋白反應(yīng)過程中產(chǎn)生的凝膠，使得疏水性氨基酸殘基得以富集，減少與味蕾的接觸，降低了苦味的強(qiáng)度.在類蛋白反應(yīng)濃縮階段，可以通過添加一些必需氨基酸，來改善多肽的營養(yǎng)價(jià)值.Fujimaki等[34]以濃度為20%大豆蛋白水解物作為底物，在pH7，37℃條件下反應(yīng)24 h，苦味基本消失.Arai等[35]報(bào)道用大豆水解產(chǎn)物合成類蛋白，在酸性磷酸酶A（Aspergillopeptidase A）和酸性羧肽酶（aspergillus Acid Carboxypeptidase）催化下，能夠水解產(chǎn)物中的異嗅物質(zhì)和苦味[34].Synowiecki等[36]以牛紅細(xì)胞Alcalase水解產(chǎn)物（強(qiáng)烈苦味）作為底物，催化類蛋白合成反應(yīng)中苦味降低至原來50%.Kanekanian等[37]用中性蛋白酶處理脫脂乳中提取的酪蛋白，經(jīng)凝膠層析后，得到3種苦味組分，利用反相液相高效色譜法進(jìn)行分析，具有強(qiáng)烈苦味的第一組分，經(jīng)過堿性蛋白酶和中性蛋白酶處理后，苦味明顯降低，脫苦的水解物的峰發(fā)生了明顯變化，疏水性區(qū)域向親水性區(qū)域轉(zhuǎn)變.用蛋白酶SK11（Lactococcus lactis subsp.cremoris） 處理契達(dá)干酪中提取的苦味肽，苦味明顯減輕，他們提取出五種苦味成分，這些成分中富含脯氨酸[38].周春霞等[39]利用類蛋白反應(yīng)對羅非魚加工下腳料進(jìn)行風(fēng)味改善，產(chǎn)物基本沒有苦味.以不同疏水性的二肽作為模型，研究蛋白酶催化類蛋白反應(yīng)改善蛋白酶解物苦味方法的可行性，在推動濃縮反應(yīng)中，不溶性物質(zhì)起著關(guān)鍵作用，這個(gè)方法是改善水解產(chǎn)物苦味肽風(fēng)味的一個(gè)潛在途徑[9].

3 展望

我國是一個(gè)水產(chǎn)大國，漁業(yè)產(chǎn)量居世界前列，但是對于水產(chǎn)品加工利用率低，原料浪費(fèi)嚴(yán)重，出口產(chǎn)品仍以初級加工產(chǎn)品為主，蛋白類制品等高端產(chǎn)品較少.類蛋白合成可以有效改善蛋白制品的風(fēng)味，提高消費(fèi)者對產(chǎn)品的接受程度，推動該類產(chǎn)品的生產(chǎn)和銷售，從而有效提升水產(chǎn)品加工的附加值.早在20世紀(jì)初，就已經(jīng)有研究人員利用蛋白酶催化合成蛋白質(zhì)的報(bào)道，到20世紀(jì)七八十年代，日本研究人員以大豆蛋白酶解液作為底物進(jìn)行類蛋白的合成試驗(yàn)，深入研究了類蛋白合成所需要的條件，這是國外研究合成類蛋白的巔峰時(shí)期，不過，我國在類蛋白合成方面的研究起步較晚，報(bào)道也較少，先有利用魚蛋白合成類蛋白、后來有利用大豆蛋白和芝麻蛋白合成類蛋白，又有以大米蛋白、玉米蛋白為底物合成類蛋白的報(bào)道.在當(dāng)今社會，綠色、天然食品深受廣大消費(fèi)者的喜愛，而且多肽產(chǎn)品較之蛋白質(zhì)更容易被人吸收，非常適合廣大的老年人和嬰幼兒.但由于合成類蛋白反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)量低而且具有可逆性，在進(jìn)一步加工過程中，苦味可能重新形成，相對于其他風(fēng)味改善方法，其成本較高，因此今后將在對類蛋白反應(yīng)機(jī)理的進(jìn)一步、系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，在反應(yīng)工藝的可控性、產(chǎn)品的穩(wěn)定性、成本降低等領(lǐng)域進(jìn)行重點(diǎn)研究，促成該技術(shù)的熟化并擴(kuò)大應(yīng)用范圍.

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RESEARCH PROGRESSON PLASTEIN REACTION IN FLAVOR IMPROVEMENT OF PROTEIN HYDROLYSATE

WANG Peng，HE Jian-dong，LUO Hong-yu
（School of Food，Pharmacy and Medicine，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316000，China）

In the enzymatic hydrolysis process of protein，protein could produce heavy bitter taste due to a large amount of hydrophobic am ino acid residues were exposed.Under the action of enzyme，the amount of hydrophobic am ino acid residues was reduced after plastein reaction so as to improve the flavor.In comparison w ith physicochemicalmethod，the plastein reaction has the advantages of no additives，no toxic and side effects and w ide application prospect.

hydrophobic am ino acid residues； plastein reaction； flavor improvement

TS201.2

A

1673-2383（2012）02-0089-06

http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20120427.1359.020.html

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2012-04-27 01:59:37 PM

2011-11-12

王朋（1987-），男，山東濰坊人，碩士研究生，研究方向?yàn)楹Ｑ笊镔Y源與利用.

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