噬菌體生物擴(kuò)增法在關(guān)節(jié)結(jié)核診治中的臨床應(yīng)用研究

李 卓，劉曉艷，申 勇，呂翠環(huán)，劉豐勝，賈晨光

（1.河北省胸科醫(yī)院骨科，河北石家莊050041；2.冀中能源峰峰集團(tuán)邯鄲醫(yī)院外科，河北邯鄲056200；3.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院脊柱外科，河北石家莊050051）

噬菌體生物擴(kuò)增法在關(guān)節(jié)結(jié)核診治中的臨床應(yīng)用研究

李 卓1，劉曉艷2，申 勇3，呂翠環(huán)1，劉豐勝1，賈晨光1

（1.河北省胸科醫(yī)院骨科，河北石家莊050041；2.冀中能源峰峰集團(tuán)邯鄲醫(yī)院外科，河北邯鄲056200；3.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院脊柱外科，河北石家莊050051）

目的探討噬菌體生物擴(kuò)增法（Phage amPlified biologically assay，PhaB）快速檢測(cè)關(guān)節(jié)結(jié)核膿液中結(jié)核分枝桿菌的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法采用PhaB技術(shù)對(duì)關(guān)節(jié)結(jié)核患者36例，非結(jié)核性關(guān)節(jié)炎患者20例關(guān)節(jié)液中的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)，同份標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行涂片抗酸染色、羅氏培養(yǎng)。結(jié)果36例關(guān)節(jié)結(jié)核積液，PhaB陽(yáng)性率為47.2%（17/36）、涂片抗酸染色陽(yáng)性率為2.7%（1/36）、羅氏培養(yǎng)陽(yáng)性率為5.5%（2/36）。20例非結(jié)核性關(guān)節(jié)炎患者PhaB、涂片抗酸染色、羅氏培養(yǎng)特異性均為100.0%。結(jié)論P(yáng)haB法檢測(cè)關(guān)節(jié)積液中結(jié)核分枝桿菌只需2d，操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)，不需要特殊儀器設(shè)備，可作為診斷關(guān)節(jié)結(jié)核的一種好方法。

結(jié)核，骨關(guān)節(jié)；分枝桿菌屬；噬菌體擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)

細(xì)菌學(xué)方法檢測(cè)關(guān)節(jié)液中結(jié)核分枝桿菌時(shí)間長(zhǎng)，涂片陽(yáng)性率低。近年來(lái)非結(jié)核分枝桿菌所致關(guān)節(jié)感染增加［1］，同時(shí)結(jié)核耐藥菌增多，特別是耐多藥結(jié)核菌的出現(xiàn)使得常規(guī)抗結(jié)核療效不佳，因而，關(guān)節(jié)結(jié)核的病原學(xué)檢測(cè)早期診斷及治療顯得尤為重要。對(duì)疑似耐藥的病例，通常術(shù)前或術(shù)中獲取標(biāo)本，行結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)+藥敏，或基因芯片快速診斷耐藥，制定個(gè)體化化療方案［2-3］。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌方法檢出率雖然較高，但實(shí)驗(yàn)過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)。涂片法雖然時(shí)間短、價(jià)格低廉，但分辨不出活菌和死菌，而且檢出率偏低，在臨床工作中應(yīng)用有一定困難。分子生物學(xué)新興技術(shù)，包括基因芯片技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，費(fèi)用較高，操作技術(shù)難度大，在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)難于推廣。噬菌體生物擴(kuò)增法（PhageamPlified biologically assay，PhaB）以簡(jiǎn)便、快速、特異性高等特性，能快速準(zhǔn)確地檢出結(jié)核分枝桿菌，使關(guān)節(jié)結(jié)核病的快速早期診斷成為可能［4］。本研究將PhaB法技術(shù)應(yīng)用于關(guān)節(jié)結(jié)核的臨床診治，早期檢測(cè)其關(guān)節(jié)液中結(jié)核分枝桿菌，探討研究該方法在關(guān)節(jié)結(jié)核早期診斷、藥敏、治療中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象：2009年5月—2011年2月在本院就診的關(guān)節(jié)結(jié)核患者36例，男性24例，女性12例，年齡16～81歲，平均45.3歲。膝關(guān)節(jié)18例，肩關(guān)節(jié)3例，腕關(guān)節(jié)6例，踝關(guān)節(jié)3例，髖關(guān)節(jié)6例。所有患者均有長(zhǎng)期（3個(gè)月～3年，平均1.3年）不同程度的膝關(guān)節(jié)腫脹、疼痛及活動(dòng)受限。膿腫形成者，局部穿刺抽取膿液，常規(guī)留取關(guān)節(jié)液標(biāo)本。另選取同期非結(jié)核性關(guān)節(jié)炎患者20例，男性12例，女性8例，年齡12～64歲，平均42.5歲。膝關(guān)節(jié)8例，髖關(guān)節(jié)6例，肩關(guān)節(jié)2例，腕關(guān)節(jié)2例，踝關(guān)節(jié)2例?；颊呔虚L(zhǎng)期（3個(gè)月～2年，平均1.2年）不同程度的膝關(guān)節(jié)腫脹、疼痛及活動(dòng)受限，常規(guī)留取關(guān)節(jié)液標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)如下。①根據(jù)病史、臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查初步診斷。②根據(jù)彩色超聲及影像學(xué)檢查顯示有關(guān)節(jié)積液形成。在無(wú)菌操作下關(guān)節(jié)穿刺抽取術(shù)前及術(shù)中積液，迅速送檢，冷藏保存，及早檢驗(yàn)，防雜菌污染、標(biāo)本失效等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要儀器及試劑：結(jié)核分枝桿菌噬菌體試劑盒（FastPlaque TB TM）由英國(guó)BiotecLaboratories Ltd公司生產(chǎn)，上海金浩科技發(fā)展有限公司提供。BACTEC MGIT-960全自動(dòng)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)，美國(guó)Becton Dickinson公司生產(chǎn)。改良羅氏培養(yǎng)基按《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》［5］自配。

1.2.2 PhaB法：①試劑準(zhǔn)備，按照試劑盒說(shuō)明在無(wú)菌條件下配制所需試劑，包括培養(yǎng)基生長(zhǎng)補(bǔ)充劑、敏感細(xì)胞溶液、瓊脂和噬菌體等。②積液標(biāo)本處理，將2mL積液標(biāo)本與同體積4%NaOH加入50mL無(wú)菌有蓋離心管中，漩渦振蕩20～30s，充分消化混勻、室溫孵育15min，再加培養(yǎng)基生長(zhǎng)補(bǔ)充劑20mL，4 000r/min離心15min，棄去上清液后再加1mL培養(yǎng)基生長(zhǎng)補(bǔ)充劑，重懸沉淀物（確保打散），用無(wú)菌吸管吸取0.1mL混懸液，轉(zhuǎn)移至反應(yīng)管中為備用待檢菌液。③含菌培養(yǎng)基的制備，分別取0.1mL噬菌體溶液加入各反應(yīng)管中充分混勻，37℃孵育1h后分別加入0.1mL殺病毒劑，充分混勻，置室溫5min后各加1mL敏感細(xì)胞溶液和5mL培養(yǎng)基液，混勻后立即將冷卻至（55±2）℃的5mL瓊脂倒于各反應(yīng)管顛倒混勻，內(nèi)容物倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿，室溫定型后將培養(yǎng)皿放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h。每次檢測(cè)均同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照為無(wú)菌培養(yǎng)基生長(zhǎng)補(bǔ)充劑，用于檢測(cè)殺病毒劑的有效性。陽(yáng)性對(duì)照為稀釋16倍的敏感細(xì)菌溶液，用于檢測(cè)噬菌體和敏感細(xì)胞的有效性。

1.2.3 抗酸染色和羅氏培養(yǎng)：同份關(guān)節(jié)液標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行離心涂片抗酸染色鏡檢，改良羅氏培養(yǎng)，操作方法按《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》［5］執(zhí)行。

1.3 結(jié)果判讀：按試劑盒說(shuō)明。實(shí)驗(yàn)組，陰性結(jié)果≤19個(gè)噬菌斑，陽(yáng)性結(jié)果≥20個(gè)噬菌斑。對(duì)照組，陰性對(duì)照≤10個(gè)噬菌斑，陽(yáng)性對(duì)照≥20個(gè)噬菌斑。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用PEMS3.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，不同檢測(cè)方法比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

3種方法對(duì)36例關(guān)節(jié)結(jié)核患者陽(yáng)性率分別為PhaB法52.7%（19/36）、抗酸染色8.3%（3/36）、羅氏培養(yǎng)30.5%（11/36），PhaB法陽(yáng)性檢測(cè)率明顯高于涂片和羅氏培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 38.725、35.821，均P＜0.01）。檢測(cè)20例非結(jié)核性關(guān)節(jié)炎患者的PhaB法、抗酸染色、羅氏培養(yǎng)特異性均為100.0%。

3 討 論

關(guān)節(jié)結(jié)核是臨床上較常見(jiàn)的疾患，常發(fā)生于少年和兒童，以髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)多見(jiàn)，肘關(guān)節(jié)、腕關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)次之。分原發(fā)性和繼發(fā)性，原發(fā)性病灶首先累及滑膜稱為滑膜型結(jié)核，后者由骨關(guān)節(jié)端結(jié)核病灶蔓延擴(kuò)散所致，稱為骨型。關(guān)節(jié)結(jié)核是結(jié)核分枝桿菌對(duì)關(guān)節(jié)的滑膜、骨及軟骨感染、破壞為主的一系列病理過(guò)程。本病以繼發(fā)感染為主，多繼發(fā)于肺結(jié)核［6］，由肺部病變后血運(yùn)轉(zhuǎn)移至骨關(guān)節(jié)發(fā)病?；颊叻尾坎∽兌嘁盐?、纖維化或鈣化。原發(fā)病灶形成多在幼年時(shí)期，結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢，通過(guò)原發(fā)病灶進(jìn)入血運(yùn)，隨血行到達(dá)骨與關(guān)節(jié)組織中，機(jī)體免疫系統(tǒng)可殺滅絕大部分，少數(shù)未被消滅的結(jié)核分枝桿菌如沒(méi)有適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，則長(zhǎng)期潛伏，處于靜止或休眠狀態(tài)，在機(jī)體的免疫力及抵抗力降低或其他不利因素的影響下，結(jié)核分枝桿菌迅速大量繁殖，突破包圍的纖維組織結(jié)構(gòu)，其數(shù)量和毒性較前增加，產(chǎn)生液化、增殖及干酪壞死病變，炎癥擴(kuò)大，產(chǎn)生局部癥狀和全身結(jié)核中毒反應(yīng)導(dǎo)致發(fā)病，關(guān)節(jié)結(jié)核由此產(chǎn)生。關(guān)節(jié)結(jié)核缺少特異性的臨床表現(xiàn)，臨床對(duì)初診患者確定診斷的難度較大，誤診率高，延誤治療導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能喪失。長(zhǎng)期應(yīng)用的細(xì)菌學(xué)方法檢測(cè)關(guān)節(jié)液中結(jié)核分枝桿菌涂片耗時(shí)較長(zhǎng)，且陽(yáng)性率低。結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)方法是一種傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，臨床應(yīng)用中陽(yáng)性率較高，但過(guò)程費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)。涂片法速度快、價(jià)格低廉，但在活菌和死菌上不能分辨，而且細(xì)菌檢出率較差，無(wú)法在臨床中應(yīng)用。PhaB技術(shù)是Wilson等［7］于1997年建立的一種快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌技術(shù)，基本原理是結(jié)核分枝桿菌與噬菌體混合孵育時(shí)，噬菌體感染結(jié)核分枝桿菌，隨后加入殺病毒劑殺死未感染的噬菌體，而菌體內(nèi)的噬菌體不受影響。感染的噬菌體在靶菌體內(nèi)繁殖并裂解釋放子代噬菌體，這些噬菌體又感染和裂解隨后加入的敏感細(xì)胞（恥垢分枝桿菌，快速生長(zhǎng)型分枝桿菌），在瓊脂培養(yǎng)基上形成噬菌斑。因此，可根據(jù)噬菌斑的有無(wú)判斷標(biāo)本中是否存在活的分枝桿菌［8］。噬菌體和敏感細(xì)胞快速的生長(zhǎng)繁殖，結(jié)果在18～24h內(nèi)就可觀測(cè)出來(lái)，結(jié)核分枝桿菌可以被可靠、迅速地檢驗(yàn)，并且可以鑒別其是否為活體細(xì)菌，這對(duì)關(guān)節(jié)結(jié)核的早期臨床診斷和指導(dǎo)抗結(jié)核藥物治療具有重要價(jià)值及意義。

本實(shí)驗(yàn)顯示，PhaB法檢測(cè)結(jié)核性關(guān)節(jié)積液中結(jié)核分枝桿菌的陽(yáng)性率為52.7%，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的涂片找抗酸菌8.3%和羅氏培養(yǎng)30.5%；特異性為100.0%。表明PhaB檢測(cè)的優(yōu)越性［9-10］。目前，臨床診斷結(jié)核病的檢驗(yàn)法有很多種，結(jié)核分枝桿菌抗酸染色是當(dāng)前最廣泛的應(yīng)用檢測(cè)之一，該檢測(cè)方法價(jià)格低廉，速度快，簡(jiǎn)單易行，便于推廣，對(duì)于含菌量較高的樣本檢出率高，但對(duì)含菌量較低的腹腔積液、胸腔積液及關(guān)節(jié)液等樣本檢出率明顯減低，不能達(dá)到早期診斷結(jié)核病的目的。羅氏培養(yǎng)法的陽(yáng)性率雖然較涂片法高，但不能快速診斷及明確藥物敏感性，對(duì)臨床上需要早期診斷并應(yīng)用敏感抗結(jié)核藥物的要求不能滿足。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中注意事項(xiàng)：①嚴(yán)格在無(wú)菌原則下抽取關(guān)節(jié)積液，裝入無(wú)菌的容器內(nèi)，冷藏保存，防止其他雜菌污染等；②消化液選擇4%NaOH，根據(jù)積液的稀稠度及是否含有干酪樣壞死物，應(yīng)當(dāng)增加消化的時(shí)間以確保效果；③為避免殺死噬菌體，澆注時(shí)瓊脂的溫度不應(yīng)過(guò)高，控制在（55±2）℃；④實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則，以免出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；⑤與少數(shù)幾種非結(jié)核分枝桿菌有交叉反應(yīng)，有文獻(xiàn)［11］報(bào)道與恥垢分枝桿菌、金色分枝桿菌、偶然分枝桿菌、草分枝桿菌會(huì)出現(xiàn)陽(yáng)性或弱陽(yáng)性反應(yīng)，從而造成假陽(yáng)性；⑥影響實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確因素復(fù)雜，藥物的濃度和作用溫度、作用時(shí)間、澆注平板時(shí)的瓊脂溫度以及殺毒劑濃度和混勻情況等都可以對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響。

在臨床中關(guān)節(jié)結(jié)核早期與滑膜炎及關(guān)節(jié)炎不易鑒別，常延誤治療，對(duì)關(guān)節(jié)功能造成嚴(yán)重后果。PhaB作為檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的一項(xiàng)新方法，在結(jié)核病的臨床研究及診治中具有重要的作用。PhaB已經(jīng)成熟應(yīng)用在結(jié)核病的早期快速診斷、治療等各方面，目前常用于肺部結(jié)核診斷治療。本研究表明PhaB在關(guān)節(jié)結(jié)核中的應(yīng)用是可靠并切實(shí)可行的，其簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速，并具有較高敏感性和特異性的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)關(guān)節(jié)結(jié)核的早期診斷、治療、保護(hù)關(guān)節(jié)功能具有重要意義。

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（本文編輯：趙麗潔）

EXPERIMENTAL STUDY OF RAPID DETECTION OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS IN JOINT FLUID BY PHAGE AMPLIFIED BIOLOGICALLY ASSAY

LI Zhuo1，LIU Xiaoyan2，SHEN Yong3，LV Cuihuan1，LIU Fengsheng1，JIA Chenguang1
（1.Department of Orthopedics，the Chest Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang 050041，China；2.Department of Surgery，the Jizhongnengyuan Handan Hospital，Handan 056200，China；3.Department of Spinal Surgery，the Third Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050019，China）

ObjectiveTo evaluate the clinical value of Phage amPlified biologically（PhaB）assay to detect mycobacterium tuberclosis in joint fluid.MethodsThe joint fluid samPles，from 36 Patients with joint tuberculosis and 20 Patients without joint tuberculosis，were detected by PhaB assay. ReSultS The Positive rate of PhaB assay in 36 Patients with joint tuberculosis was 47.2%（17/36），those of smear and culture were 2.7%（1/36）and 5.5%（2/36）resPectively.Twenty samPles without joint tuberculosis were all negative by above three methods.ConclusionThe exPerimental Procedure of PhaB assay costs only 2 days，and it is a simPle，highly sensitive and sPecific method for the diagnosis of joint tuberculosis.

tuberculosis，osteoarticular；mycobacterium；Phage amPlified biologically assay

R529.2

A

1007-3205（2012）05-0525-03

2012-02-28；

2012-05-09

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃（20090262）

李卓（1975-），男，河北隆堯人，河北省胸科醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事骨科疾病診治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.05.012