骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝纖維化研究進(jìn)展

曹慧穎，邵 鵬（綜述），石金升（審校）

（河北省滄州市和平醫(yī)院內(nèi)三科，河北滄州 061001）

·綜 述·

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝纖維化研究進(jìn)展

曹慧穎，邵 鵬（綜述），石金升（審校）

（河北省滄州市和平醫(yī)院內(nèi)三科，河北滄州 061001）

間質(zhì)干細(xì)胞；肝硬化；綜述文獻(xiàn)

肝纖維化、肝硬化是多種慢性肝臟疾病的終末期病理表現(xiàn)，目前傳統(tǒng)的治療手段難以從根本上修復(fù)肝臟的不可逆變化，肝臟原位移植是治療各種終末期肝病的有效方法，但是由于供體來源不足、操作復(fù)雜、移植后免疫排斥、治療費(fèi)用昂貴等問題，限制了臨床肝移植的發(fā)展。隨著細(xì)胞移植技術(shù)的成熟，肝細(xì)胞移植有望從根本上治療肝臟疾病。干細(xì)胞方面的研究為解決肝細(xì)胞來源問題帶來了希望［1］。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有自我增殖和分化潛能的多能干細(xì)胞，由于骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞易于取材，未涉及倫理，而被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究?，F(xiàn)將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）治療肝纖維化的實(shí)驗(yàn)進(jìn)展及機(jī)制研究作一綜述。

1 BMSCs治療肝纖維化的可行性

BMSCs是具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞。中胚層的BMSCs可以跨越胚層向內(nèi)胚層及外胚層的組織、細(xì)胞分化。比如分化為肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞等。研究者［2］稱之為“可塑性”或“橫向分化”。BMSCs在特定條件下橫向分化為肝細(xì)胞的研究為其移植治療肝纖維化提供了理論依據(jù)。

吳玉卓等［3］取肝硬化患者骨髓，體外加入細(xì)胞因子（肝細(xì)胞生長因子、表皮生長因子單獨(dú)或聯(lián)合）誘導(dǎo)BMSCs向肝樣細(xì)胞分化，結(jié)果顯示誘導(dǎo)組細(xì)胞可在2l～28d時(shí)，變?yōu)槿切?、多角型或類圓形。誘導(dǎo)組細(xì)胞7d檢測(cè)到甲胎蛋白的表達(dá)，2 l、28d檢測(cè)出細(xì)胞角蛋白18陽性，并以時(shí)間依賴方式產(chǎn)生白蛋白。趙文靜等［4］在體外分離獲得純度較高的人BMSCs，在體外用酒精性肝硬化患者血清誘導(dǎo)，結(jié)果示人BMSCs表達(dá)甲胎蛋白及白蛋白，且向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化?？傊?，骨髓中確實(shí)存在能分化為肝細(xì)胞的干細(xì)胞，直接將其移植到肝臟，在肝臟微環(huán)境調(diào)節(jié)下可分化為肝細(xì)胞；將BMSCs作為肝細(xì)胞移植的細(xì)胞來源有重要的臨床意義。

2 BMSCs治療肝纖維化的機(jī)制

對(duì)于治療肝纖維化來說，最有效的方法莫過于去除病因治療（清除乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒，減少乙醇攝入，控制脂肪攝入等）。在細(xì)胞移植治療方面，一些體內(nèi)、外的研究［5］均提示BMSCs可以有效地減輕肝纖維化的病變，其治療的機(jī)制主要集中于下列幾個(gè)方面。

2.1 BMSCs促進(jìn)肝細(xì)胞再生：肝硬化的形成過程中是以假小葉形成為主要的病理特點(diǎn)，纖維膠原的沉積會(huì)導(dǎo)致大量正常的肝細(xì)胞變性甚至死亡。即使肝臟是再生能力很強(qiáng)的器官，但經(jīng)過慢性病因的長期損傷后，最終的趨勢(shì)還是會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡，肝功能受損。BMSCs在移植后可分化成肝細(xì)胞樣細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)源性肝細(xì)胞的再生，有效補(bǔ)充肝細(xì)胞的數(shù)量，從而有效地改善肝功能。在BMSCs植入由四氯化碳誘導(dǎo)的纖維化病肝后，BMSCs不但可以在病變肝臟內(nèi)定植，有效減輕肝纖維化的病變，而且可以有效地促進(jìn)內(nèi)源性肝細(xì)胞再生［6］。安德偉等［7］利用體外誘導(dǎo)（利用肝細(xì)胞生長因子）的BMSCs定向分化為肝細(xì)胞，在移植入纖維化病肝后出現(xiàn)更多表達(dá)白蛋白的細(xì)胞，說明BMSCs在肝纖維化的環(huán)境下可以有效地誘導(dǎo)肝細(xì)胞再生。Aziz等［8］通過將BMSCs由尾靜脈注入肝纖維化模型鼠內(nèi)亦可發(fā)現(xiàn)BMSCs具有向肝細(xì)胞方向的轉(zhuǎn)化及減輕肝纖維化的功能。2.2 BMSCs分泌細(xì)胞因子/生長因子而抑制炎癥反應(yīng)：BMSCs分泌多種細(xì)胞因子和生長因子，如肝細(xì)胞生長因子、干細(xì)胞因子、基質(zhì)源因子1α、轉(zhuǎn)化生長因子-β、腫瘤壞死因子-α等。其中肝細(xì)胞生長因子不但具有誘導(dǎo)BMSCs自身向肝細(xì)胞分化的功能，還抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1產(chǎn)生，阻止肝臟纖維化，抗肝細(xì)胞凋亡，從而提高存活率。白細(xì)胞介素-10能破壞腫瘤壞死因子的纖維化信號(hào)傳導(dǎo)通路，減少纖維化，轉(zhuǎn)化生長因子-β卻促進(jìn)肝星形細(xì)胞的纖維化反應(yīng)，是肝纖維化最主要的致病因子，可以激活轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB，引起一系列靶基因的激活。而Di Nicola等［9］用骨髓細(xì)胞與異體樹突狀細(xì)胞或外周血淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)，結(jié)果表達(dá)的轉(zhuǎn)化生長因子-β1和肝細(xì)胞生長因子顯著抑制CD4+和CD8+細(xì)胞的增殖活性［（65±5）%、（75±15）%］，表明BMSCs具有很強(qiáng)的抑制免疫排斥和炎癥反應(yīng)作用。

2.3 BMSCs抑制肝星形細(xì)胞活化、阻止細(xì)胞外基質(zhì)的生成：肝星形細(xì)胞是正常肝和纖維化時(shí)合成細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞。肝星形細(xì)胞的過度激活導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。研究［10］發(fā)現(xiàn)，肝星形細(xì)胞與BMSCs體外共培養(yǎng)后，肝星形細(xì)胞增殖活性明顯受抑制，說明BMSCs具有分泌細(xì)胞因子抑制肝星形細(xì)胞增殖活性的潛能，這在治療肝纖維化中發(fā)揮作用。Kim等［11］認(rèn)為其機(jī)制是BMSCs可能通過肝細(xì)胞生長因子阻斷細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的磷酸化作用，抑制α-平滑肌蛋白陽性細(xì)胞的增殖，使門脈區(qū)成纖維細(xì)胞的生長抑制、凋亡增加，從而緩解肝纖維化進(jìn)展。

2.4 MSCs激活卵圓細(xì)胞，促進(jìn)肝細(xì)胞再生：卵圓細(xì)胞被認(rèn)為是肝細(xì)胞的前體細(xì)胞。轉(zhuǎn)化生長因子-β/腫瘤壞死因子-α無論體內(nèi)外都阻止肝細(xì)胞增殖，而對(duì)于卵圓細(xì)胞增殖影響不大?？赡苻D(zhuǎn)化生長因子-β/腫瘤壞死因子-α作用于兩種細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制不同?；|(zhì)源因子1α可以激活卵圓細(xì)胞，在肝細(xì)胞再生過程中發(fā)揮作用。因而BMSCs在分泌上述細(xì)胞因子時(shí)起到激活卵圓細(xì)胞、促進(jìn)肝細(xì)胞再生的作用。

2.5 MSCs降解肝內(nèi)過量的膠原：有研究［12］將MSCs與肝纖維化的病理模型一起共培養(yǎng)，結(jié)果顯示MSCs可以有效地減少膠原的沉積及降解已沉積的膠原，從而明顯減輕肝纖維化的病變程度。

3 基礎(chǔ)研究

基礎(chǔ)研究通過不同方法構(gòu)建肝硬化動(dòng)物模型，將各種類型的干細(xì)胞通過不同途徑應(yīng)用于動(dòng)物模型，觀察移植細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸、肝臟組織學(xué)改變、各種蛋白表達(dá)及血清因子水平的變化，來評(píng)價(jià)細(xì)胞移植的安全性及有效性，并初步闡明了細(xì)胞移植治療肝硬化的可能機(jī)制。

段峰等［13］應(yīng)用介入技術(shù)將兔BMSCs超選擇性移植入肝硬化兔門靜脈分支內(nèi)，移植后3周，熒光免疫組織化學(xué)顯示移植的BMSCs可以在病理性肝臟組織內(nèi)存活；血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶下降，與移植前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Chang等［14］將人BMSCs通過門靜脈輸入肝硬化模型鼠體內(nèi)，移植后1d發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白標(biāo)記的移植細(xì)胞遷移到肝小葉周邊及血管周圍，生化及組織病理學(xué)顯示肝損傷明顯減輕，且移植的細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶，肝纖維化亦明顯改善。劉彥等［15］將BMSCs誘導(dǎo)分化的肝樣細(xì)胞移植到同種大鼠已纖維化的肝臟，結(jié)果顯示肝樣移植細(xì)胞逐漸從血管進(jìn)入肝臟實(shí)質(zhì)，最終散布于肝細(xì)胞間，移植后第2周，肝組織中的假小葉逐漸吸收或消散，纖維化程度明顯輕于模型對(duì)照組，膠原染色變淺。移植后第4周肝細(xì)胞排列接近正常，偶見點(diǎn)狀壞死，無纖維間隔。

4 臨床應(yīng)用

在國內(nèi)外大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的理論支持下，干細(xì)胞治療肝硬化的臨床應(yīng)用逐步開展，并已取得可喜成果，為眾多肝硬化患者帶來新希望。

Zhong等［16］發(fā)現(xiàn)感染的肝硬化患者與健康供者BMSCs相比，增殖能力差，生長因子受體的表達(dá)水平及分泌生長因子的能力降低，初步認(rèn)為患者自身BMSCs不適合用于疾病的治療。郭曉鐘等［17］體外分離純化BMSCs，通過肝動(dòng)脈置管移植入肝臟，在移植后2、4、8周復(fù)查肝臟功能，觀察實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)改善，Child-Turcotte-Pugh分?jǐn)?shù)變化及不良反應(yīng)情況。結(jié)果移植后第4周，患者血漿白蛋白由（32.91±5.58）g/L升至（38.32±6.45）g/L，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶由術(shù)前（96.92±83.91）U/L降至（73.48±18.46）U/L（P＜0.01）。凝血酶原時(shí)間從移植前的（16.66±3.91）s逐漸下降至移植后的（15.52±3.35）s，纖維蛋白原從（2.22±0.88）g/L逐漸升高至（2.58±0.88）g/L。移植術(shù)后患者臨床癥狀明顯改善，其中食欲改善、體力好轉(zhuǎn)72例（92.3%），腹水減少或消失及下肢浮腫減輕70例（89.7%），腹脹減輕68例（87.2%）。陳薇等［18］對(duì)11例失代償期肝硬化患者經(jīng)肝動(dòng)脈行外周血干細(xì)胞移植治療，移植后2、4、8、12周，總膽紅素逐漸下降有9例（81.82%），白蛋白逐漸升高8例（72.73%），凝血酶原活動(dòng)度逐漸升高10例（90.91%）；移植后12周內(nèi)，腹水減輕7例（63.64%），食欲改善8例（72.73%），體力好轉(zhuǎn)7例（63.64%），腹脹減輕7例（63.64%）。除1例出現(xiàn)輕微骨痛以外，未發(fā)現(xiàn)其他明顯不良反應(yīng)及并發(fā)癥。王迪等［19］經(jīng)肝動(dòng)脈移植自體BMSCs治療肝硬化失代償期患者40例，移植后第2、4、8周復(fù)查肝功能，觀察實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，臨床癥狀及不良反應(yīng)情況。結(jié)果顯示移植后第4周，血漿白蛋白明顯升高，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶與移植前相比顯著下降；干細(xì)胞移植后4周，凝血機(jī)制明顯改善，凝血酶原時(shí)間逐漸下降，纖維蛋白原逐漸升高；患者生存質(zhì)量顯著提高：食欲改善、體力好轉(zhuǎn)37例（92.5%），腹脹減輕33例（82.5%），腹水減少、下肢水腫減輕35例（87.5%）。全部患者術(shù)中未發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥，術(shù)后近期無不良反應(yīng)出現(xiàn)。Pai等［20］對(duì)9例酒精性肝硬化患者用粒細(xì)胞集落刺激因子進(jìn)行外周血干細(xì)胞動(dòng)員后，采集干細(xì)胞，對(duì)CD34+細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增后經(jīng)肝動(dòng)脈回輸給患者，結(jié)果顯示細(xì)胞擴(kuò)增后可達(dá)2.3×108個(gè)，所有患者均耐受，未出現(xiàn)治療相關(guān)不良反應(yīng)，移植后4、8、12周時(shí)，血清膽紅素水平均顯著下降，1周后丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶亦顯著改善；9例患者中Child-Pugh評(píng)分改善7例，腹水減輕5例。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果促進(jìn)臨床研究的進(jìn)一步發(fā)展。Kharaziha等［21］將自體（3～5）×107個(gè)BMSCs通過門靜脈或外周輸注給8例不同原因?qū)е碌母斡不颊撸Y(jié)果顯示所有患者均耐受，肝功能明顯改善：終末期肝病評(píng)分和凝血酶原復(fù)合物比率顯著下降，血清肌酸酐和膽紅素下降，白蛋白升高，未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)。

但亦有研究并不支持BMSCs對(duì)肝纖維化的治療作用。Dalakas等［22］將BMSCs應(yīng)用于酒精性肝損傷的患者，結(jié)果顯示移植后患者肝組織中和血液中CD34+細(xì)胞數(shù)［（1.834±0.605）%和（0.195%± 0.063）%］較對(duì)照組［（0.299±0.208）%和（0.067%±0.010）%］顯著增加（P＜0.05）。認(rèn)為這些數(shù)量增多的CD34+可能是肝損傷后造成的內(nèi)源性干細(xì)胞釋放入外周血和肝臟中，這些細(xì)胞促進(jìn)了成纖維細(xì)胞的生成，但并未發(fā)現(xiàn)與移植相關(guān)的肝細(xì)胞再生與修復(fù)。

5 問題及展望

細(xì)胞治療作為生物治療主要手段之一，正逐漸為更多的患者所接受。我院與中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)作開展的肝硬化之干細(xì)胞治療項(xiàng)目，應(yīng)用自體BMSCs轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞生長因子基因，通過靜脈或肝動(dòng)脈介入的方式回輸給肝硬化患者，亦已取得初步成功。雖然干細(xì)胞治療肝硬化是一種新生療法，還需長期和大量臨床數(shù)據(jù)來證實(shí)其有效性、安全性及其治療機(jī)制。但鑒于目前肝硬化有效手段缺乏的情況下，權(quán)衡利弊，選擇干細(xì)胞治療亦是對(duì)生命的挑戰(zhàn)，期望更多患者能早日從中受益，最大程度地?cái)[脫疾苦。

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（本文編輯：趙麗潔）

R575.2

A

1007-3205（2012）02-0240-04

2011-03-21；

2011-06-23

曹慧穎（1975-），女，河北滄州人，河北省滄州市和平醫(yī)院主治醫(yī)師，從事內(nèi)科疾病診治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.02.052