白藜蘆醇等芪類合成酶研究進展

周 晉，李順祥，曹 亮，虢小翊，顏新培，黃 丹

（1.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；2.湖南農(nóng)業(yè)大學生物科技學院，湖南 長沙 410128；3.湖南省蠶?？茖W研究所，湖南 長沙 410127）

芪類（Stilbenes）是具有均苯二烯母核或其聚合物的一類物質總稱[1]，由于其在植物生理學、藥物學和在人類健康中的潛在價值而被廣泛研究[2]，其中白藜蘆醇和氧化白藜蘆醇是最有代表性的芪類成分。白藜蘆醇是植物在抵御生物或非生物脅迫中產(chǎn)生的植物保護素[3]，廣泛存在于葡萄等植物中。氧化白藜蘆醇（oxyresveratrol）抑制黑色素的作用可以達到美白，祛斑的作用，主要應用于化妝品[4]，存在于桑等植物中。本文就白藜蘆醇等芪類化合物的合成酶及合成基因的相關研究進行綜述。

1 芪類化合物的合成酶及生物合成組織特異性

1.1 合成酶結構功能

芪類是苯丙酸途徑合成的簡單化合物，該途徑最關鍵的酶是芪合酶（malonyl-CoA:4-coumaroyl-CoA malonyltransferase；EC 2.3.1.95；stilbene synthase STS）[5]，STS在植物中多以基因家族存在，已克隆的STS可分為2種類型。一種為白藜蘆醇合成酶 （3,5,4'-三羥基二苯乙烯合酶），以4-香豆酰-CoA和丙二酰-CoA為底物合成白藜蘆醇；另一種為赤松素合成酶，合成赤松素（Pinosylvin）[6]。

STS是帶一個亞基的二聚體，分子量為43 000 道爾頓，等電點5.4[7]。T Lanz等[8]對STS和CHS的6個保守Cys進行定點突變分析，發(fā)現(xiàn)只有169位的Cys對兩種酶是必需的。王冰梅等[9]通過對花生白藜蘆醇合酶基因DNA 的克隆，并與幾種芪合酶及查爾酮合酶的DNA 序列比較證實，芪合酶結合底物的活性中心半胱氨酸（Cys）位置一般為Cys164或Cys169。

1.2 生物合成組織特異性

Wang W等[10]研究葡萄中白藜蘆醇積累的組織特異性及白藜蘆醇合酶蛋白水平的調節(jié)機制和組織定位，發(fā)現(xiàn)葡萄幼株莖的韌皮部含量最高，葉中含量最低；而芪合酶mRNA和酶蛋白含量在葉中最高；亞細胞定位發(fā)現(xiàn)不同組織的細胞壁芪合酶分布最多；紫外光照射下，白藜蘆醇和芪合酶在葡萄葉中都被強烈刺激，表明白藜蘆醇和芪合酶都有器官或組織特異性。Fornara V等[11]研究了芪合酶在葡萄果實發(fā)育期在漿果中的定位，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇的順反異構體主要在外果皮中積累；亞細胞定位發(fā)現(xiàn)芪合酶主要在囊泡中。

2 芪類合成相關酶基因的研究

2.1 芪合酶基因結構功能

芪合酶中的白藜蘆醇RS基因序列被廣泛報道并在GENEBANK注冊，如從東方白松（Pinus strobus）克隆到2個芪合酶基因[12]。從日本紅松（Pinus densiflora）中分離得到1個STS cDNA[13]。從大黃的根莖中發(fā)現(xiàn)1個RtSTS[14]基因。白藜蘆醇RS基因 序列分析顯示5'上游-33位點存在TATA盒子，編碼區(qū)起始于第1個ATG，5'端包含有唯一的內含子（179-547位點），將RS基因的編碼區(qū)分成兩部分[15]。最近發(fā)現(xiàn)芪合酶基因啟動子的轉錄起始點接近162bp處是建立誘導表達所必須的[16]。

2.2 芪合酶基因誘導表達

Schmidlin L等[17]克隆了氧化白藜蘆醇鄰甲基轉移酶（resveratrol O-methyltransferase ROMT）基因，并將其轉入煙草證實了其活性，且其表達受到紫外線、AlCl3等的誘導。Gamm M等[18]研究發(fā)現(xiàn)葡萄霜霉菌在葡萄葉片中、灰葡萄孢菌在葡萄漿果中誘導表達ROMT。Deluc LG等[19]研究發(fā)現(xiàn)，水分缺失導致葡萄（Vitis vinifera）漿果中白藜蘆醇苷的增加，顯著提高芪類合成前體物基因的轉錄，芪合酶表達增加。大量研究證實芪合酶基因表達的誘導因素包括病原真菌、紫外線[3]、水等生物或非生物脅迫因素。

3 芪合酶基因轉基因利用

3.1 抗真菌性的轉基因應用

2011年Liu等[20]最新克隆了廖屬植物的STS基因，將其用（CaMV）35S啟動子進行啟動，轉化到擬南芥中進行表達，通過HPLC，HPLC-ESI -MS等檢測，發(fā)現(xiàn)在擬南芥中表達了一個反式-白藜蘆醇苷，其表達產(chǎn)物能抑制炭疽病病原體次盤孢（Colletotrichum higginsianum）的孢子產(chǎn)生從而抑制該病菌，由此可見該基因可以加強作物的抗病原菌性和品質，且進一步研究表明轉基因植株種子顏色有變化，花青素水平顯著降低，但查耳酮基因的表達沒有下調，這可能是因為增加的STS的活性導致查耳酮合酶前體的缺乏從而干擾接下來的黃酮類的合成。轉芪合酶基因進行抗病性研究一直是眾多研究者熱衷的方向。

3.2 轉基因次生代謝產(chǎn)物合成特征

Lo C等[21]采用（LC/MS/MS）分析高粱芪合酶基因在擬南芥中表達合成的白藜蘆醇糖基化產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇二糖苷含量達到2.79 mg/g。Schwekendiek A等[22]將組成型表達的芪合酶基因轉入啤酒花（Humulus lupulus L.）檢測發(fā)現(xiàn)云杉新甙的含量達560 mg/g濕重，而非轉基因的對照沒有產(chǎn)生。Giovinazzo等[23]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄芪合酶基因轉入到番茄中，能夠合成反式白藜蘆醇及反式白藜蘆醇苷。然而伴隨著RS基因的轉入，某些植物性狀出現(xiàn)變異。Fischer等[24]葡萄白藜蘆醇RS基因轉人到煙草中，雖獲得了高含量白藜蘆醇的煙草，但其花粉失去活力，花色改變。Hanhineva K等[25]將編碼葡萄芪合酶的NS-Vitis3基因轉入到草莓，發(fā)現(xiàn)肉桂酸、阿魏酸鹽有所增加，黃酮類含量降低，而白藜蘆醇沒有檢測到。苗曉燕等[26]研究表明，在轉白藜蘆醇合成酶基因的虎杖毛狀根中，白藜蘆醇苷的含量均得到顯著提高，而白藜蘆醇含量提高不顯著。由眾多研究可以看出，轉RS基因不一定能得到白藜蘆醇這一次生代謝產(chǎn)物，多為其結構類似物，轉基因對植物的性狀和其它次代產(chǎn)物的合成有一定影響，其中涉及到廣泛的生理生化過程。

4 應用前景及展望

植物抗病育種和生物活性成分的有效利用是開展對芪類化合物合成相關酶研究的動力，白藜蘆醇等活性物質的有效利用對現(xiàn)代醫(yī)療保健具有重要意義，如白藜蘆醇的保健作用，氧化白藜蘆醇的護膚等重要應用，正推動著產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。通過基因工程的手段對芪類成分合成酶基因進行合理的利用，有望在植物抗病育種，天然藥物開發(fā)等方面取得重大成績。但同時還應注意到芪合酶轉基因過程中出現(xiàn)的安全和植物性狀改變等問題，并且要協(xié)調好植物自身的代謝產(chǎn)物的關系。

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