人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及治療肺纖維化的作用機(jī)制

王 雁 劉 晨 王紅陽 劉信榮

(河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院 河北唐山 063000)

肺纖維化是以大量的成纖維細(xì)胞聚集、細(xì)胞外基質(zhì)沉積并伴有炎癥和損傷所致組織結(jié)構(gòu)破壞為特征。其病理特點(diǎn)包括肺組織間質(zhì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)增生沉積及肺實(shí)質(zhì)的重構(gòu)，其發(fā)病率和病死率各不相同，嚴(yán)重性各異，但共同特點(diǎn)是缺少特異性治療。過去對肺纖維化疾病的治療僅限于非特異性抗炎、免疫抑制劑及糖皮質(zhì)激素等，療效尚不理想。隨著肺纖維化發(fā)病機(jī)制研究的深入，細(xì)胞移植替代治療成為近年來治療肺纖維化研究熱點(diǎn)。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)作為人成體干細(xì)胞的一種，1966年首先由Friedenstein［1］從骨髓中發(fā)現(xiàn)，然而經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞雖然易于培養(yǎng)、可大量擴(kuò)增、遺傳背景相對穩(wěn)定且多向分化特性不會(huì)受到影響［2］，它具有潛在得組織修復(fù)能力、抗增殖和抗炎癥效應(yīng)的作用。逐漸成為細(xì)胞療法和基因療法得一種理想的靶細(xì)胞。但在臨床應(yīng)用中存在不足之處，如骨髓一般從患者自身采集，須行骨髓穿刺術(shù)，存在被病毒污染的可能及有一定的風(fēng)險(xiǎn)。另外，患者自身體質(zhì)較弱易有感染使得間充質(zhì)干細(xì)胞不能滿足個(gè)體需要。因此尋找新的MSCS來源是目前國內(nèi)外干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。近些年來，人們對人臍血的研究進(jìn)一步深入。Erics等［3］于2000年最早報(bào)道了臍血中存在間充質(zhì)干細(xì)胞，它是一種具有全能干細(xì)胞特點(diǎn)的細(xì)胞，具有多向分化潛能，其形態(tài)和生物學(xué)特點(diǎn)與骨髓源性MSCs相似。很多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在一定的實(shí)驗(yàn)條件下可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞［4］、骨骼肌細(xì)胞［5］等。與骨髓相比，臍帶血有以下優(yōu)勢:①來源廣泛，便于取材;②細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)、分化好;③對供者無不利影響，無論理道德問題的限制，適合體外大規(guī)模培養(yǎng);④臍血的免疫原性較弱，能耐受更大程度上的HLA配型不符［1，6］;⑤移植物抗宿主病(GVHD)發(fā)生率較低。這些優(yōu)勢為臍血間充質(zhì)干細(xì)胞作為新一代“種子”細(xì)胞治療一些機(jī)體無法自然修復(fù)的組織細(xì)胞損傷，有著良好的臨床應(yīng)用前景。本文就人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及治療肺間質(zhì)纖維化的進(jìn)展做一綜述。

1 HUCBMSCs的生物學(xué)特性

臍血又稱胎盤血或臍帶血，是新生兒出生時(shí)臍帶內(nèi)和胎盤近胎兒一側(cè)血管內(nèi)的血液。臍血成分基本上與成人血一樣，包括血細(xì)胞和血漿。臍血血細(xì)胞包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板三部分。Gerli等人研究認(rèn)為盡管臍血T淋巴細(xì)胞具備增生能力，但低于成人，臍血T細(xì)胞表達(dá)IL2基因以及HLA－DR和生成IL2基因以及HLA－DR和生成IL2不足。這說明臍血缺乏致敏的T細(xì)胞，移植排異反應(yīng)(GVHD)較成人緩慢且弱。B淋巴細(xì)胞表現(xiàn)功能也不成熟狀態(tài)，臍血免疫細(xì)胞的不成熟性是臍血移植的基礎(chǔ)。大量研究表明，人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)MHC－I類分子及 B7 －1、B7 －2、CD40、CD40L 等［7］共刺激分子，導(dǎo)致免疫耐受。

隨著對臍血的深入研究，臍血間充質(zhì)干細(xì)胞已被眾多實(shí)驗(yàn)室成功分離。Eun ji Gang等［8］將人的臍血分離培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)單個(gè)核細(xì)胞傳至第二代時(shí)即可見大量均一的成纖維狀貼壁細(xì)胞，大約86%的細(xì)胞處于G0/G1期，這表明這些細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖潛能。另外，研究發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞特性和多向分化潛能與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似，體外擴(kuò)增能力、細(xì)胞原始性高于骨髓。但人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞目前缺少特異性表面標(biāo)記物，鑒定方法都是通過形態(tài)、功能以及在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的分化表型，經(jīng)流式細(xì)胞儀技術(shù)分析:臍血 MSCs表達(dá) CD29、CD44、CD54、CD58、CD90、CD95、CD166、SH －2、SH －3、SH －4，不表達(dá) CD14、CD34、CD40、CD45、CD50、CD68、CD80、CD86、CD117、CD152 及 HLA －DR，這與骨髓MSCs的免疫表型相似。

2 人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞可能向肺組織細(xì)胞的分化

2.1 肺間質(zhì)纖維化形成的可能機(jī)制 目前認(rèn)為，肺纖維化是由于各種原因?qū)е路螕p傷后，修復(fù)不足造成的。由于I型肺泡上皮細(xì)胞廣泛損傷，II型肺泡上皮細(xì)胞不能及時(shí)分化為I型肺泡上皮細(xì)胞修復(fù)正常肺組織結(jié)構(gòu)，以及損傷后炎癥細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子(如TGF－β)相互作用，從而造成成纖維細(xì)胞大量聚集，最終形成肺纖維化。

2.1.1 TGF－β在肺纖維化形成過程中的作用。TGF－β是Assoian等在1983年從人血小板中首次提取出來的，是研究最深入、最重要的細(xì)胞因子，它是一種多效性的細(xì)胞因子，可由T細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、血小板和結(jié)構(gòu)細(xì)胞產(chǎn)生，包括成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞，它對炎癥細(xì)胞、免疫細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞有著重要的影響。在肺纖維化組織中，TGF－β表達(dá)增強(qiáng)，它能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的大量產(chǎn)生，使細(xì)胞外基質(zhì)受體表達(dá)增強(qiáng)，導(dǎo)致膠原沉積，另外，TGF－β還可抑制降解酶的活性，使膠原降解減少，同時(shí)抑制蛋白水解酶，減少細(xì)胞外基質(zhì)降解，TGF－β刺激成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表達(dá)，促使合成和分泌更多的膠原，經(jīng)過這一系列的反應(yīng)，最終引起肺纖維化。

2.1.2 上皮細(xì)胞－間質(zhì)細(xì)胞間的轉(zhuǎn)化。EMT(epithelia l－mesenchymal tran－sition，EMT)是一種完全分化的上皮細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞表型改變轉(zhuǎn)化成完全分化的間質(zhì)細(xì)胞的過程，通常轉(zhuǎn)化成成纖維細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞［9］，這種現(xiàn)象在過去一直認(rèn)為是不太可能的。在肺組織中，肺泡上皮以及上皮損傷對纖維化的形成起著重要作用。II型肺泡上皮細(xì)胞被認(rèn)為是損傷后修復(fù)肺泡上皮的原始細(xì)胞，它能夠自我更新和轉(zhuǎn)分化成為I型肺泡上皮細(xì)胞［10］在某些特定條件向I型肺泡上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化受抑制時(shí)(如損傷)，II型肺泡上皮細(xì)胞也有能力通過EMT過程轉(zhuǎn)變成成纖維細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞。這提示了體內(nèi)肺泡上皮細(xì)胞EMT的存在，并表明EMT可能在肺纖維化的發(fā)病機(jī)制中起很重要的作用。

2.2 人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞移植對肺纖維化的修復(fù)機(jī)制

2.2.1 直接或間接轉(zhuǎn)化為肺泡上皮細(xì)胞。近些年許多動(dòng)物和人體實(shí)驗(yàn)報(bào)道，來自肺外的一些細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為肺的分化細(xì)胞。II型肺泡上皮細(xì)胞可以分裂產(chǎn)生子代II型肺泡上皮細(xì)胞，也可分化為I型肺泡上皮細(xì)胞，因此在功能上相當(dāng)于肺的干細(xì)胞［11］在肺纖維化過程中，有人認(rèn)為MSCs可能通過替代損傷的II型肺泡上皮細(xì)胞從而減輕纖維化的程度。Ortiz等［12］將來源于博萊霉素抵抗的雄性小鼠的MSCs注入對博萊霉素依賴的雄性小鼠的體內(nèi)，在后者肺組織中可獲得由供體MSCs分化的肺泡II型細(xì)胞。幫助修復(fù)肺損傷，減輕纖維化程度。Theiseo［13］的通過實(shí)驗(yàn)研究顯示博萊霉素造成肺損傷5 d后，肺內(nèi)可以見到骨髓來源的細(xì)胞，6個(gè)月后可達(dá)14%。這些實(shí)驗(yàn)表明外源性Msc可以遷移到肺并轉(zhuǎn)化為肺的分化細(xì)胞。Sueb linvong等［14］通過體外分離、培養(yǎng)臍血源性間充質(zhì)干細(xì)胞(Human umb－ilicalcordderived MSCs)，證實(shí)了臍血源性MSC s通過靜脈輸入后可定植在氣道上皮并表達(dá)氣道上皮細(xì)胞表型，參與氣道重建。

2.2.2 MSCs對TGF－β的作用。MSCs對抗肺纖維化的另一重要機(jī)制可能為通過產(chǎn)生TGF－β受體，使之與TGF－β結(jié)合，減少TGF－β在肺組織的作用，減少膠原沉積，細(xì)胞外基質(zhì)可以降解，阻止肺損傷早期成纖維細(xì)胞的惡性聚集。

3 存在的問題

近年來，細(xì)胞替代治療在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域成為研究的熱點(diǎn)，尤其對人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的研究取得了很大的進(jìn)展，它被認(rèn)為是傳統(tǒng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的新生力量，具有優(yōu)越的生物學(xué)特性和很好的增殖分化潛能。但由于肺部結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，人臍血MSCs的研究落后于其他器官，相關(guān)研究結(jié)果大多數(shù)還都停留在動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)階段，缺乏足夠的臨床實(shí)驗(yàn)依據(jù)。對于人臍血MSCs治療肺纖維化的機(jī)制尚不十分清楚。還有許多亟待解決的問題:①人臍血MSCs還沒有找到特異性的標(biāo)記分子，目前對人臍血MSCs的辨別還局限于從細(xì)胞形態(tài)、非特異的免疫表型。②到目前為止還沒有十分完善的分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增MSCs的方案，造成不同實(shí)驗(yàn)室在研究同一組織來源干細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞表型、起始細(xì)胞異質(zhì)性、分化能力、增殖能力、長期養(yǎng)后的細(xì)胞功能等存在較大差異，直接影響了間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用［15］。③在肺纖維化組織中，移植的人臍血MSCs雖然可以在肺組織中停留，并且發(fā)揮一定的修復(fù)作用，但究竟是轉(zhuǎn)化為II型肺泡上皮細(xì)胞或其他實(shí)質(zhì)細(xì)胞，還是通過分泌某些細(xì)胞因子減輕肺纖維化程度還有待進(jìn)一步研究。

相信隨著研究的進(jìn)一步深入，人臍血MSCs的生物學(xué)特性將越來越清楚，作為新一代的種子細(xì)胞，人臍血MSCs將在進(jìn)一步完善作用機(jī)制和臨床研究的基礎(chǔ)上，很有可能成為治療肺纖維化的重要手段。

［1］Friedenstein A J，Piatetzky－shapiro II，Petrakova KV.Osteogenesis in transplants of bone marrow cells［J］.Embryol exp Morph，1966，16(3):581

［2］Jaiswal N，Haynesworth S E，Caplan AI，et al.Osteogenic differentiation of purified，culture－ expanded human mesenchymal stem cells in vitro［J］.Cell Biochem，1997，64(2):295

［3］Erices A，Conget PA，Mingull JJ.Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood［J］.Br J Haematology，2000，109:235

［4］Leek OK，Kuo TK，Chen WM et al.Blood［J］.2004，103:1669 －1675

［5］Hang EJ，Jeong JA，Hpng SH，et al.Blood［J］.2004，1669 －1675

［6］Nakahata T，Ogawa M.Hemopoietic colony－forming cells in umbilical cord bloodwith extensive Capability to generate mono and multipotential hemopoietic progenitors［J］.Clin Invest，1982，70:1324

［7］遲作華，張 洹.臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的研究進(jìn)展［J］.國際生物醫(yī)學(xué)工程雜志，2006，29(1):29

［8］Eun ji Gang，Seung Hyun Hong，Ju Ah Jeong，et al.Biochemical and Bi－ ophysical［J］.Research Communications，2004，321:102

［9］Zavadil J，Büttinger EP.TGF － beta and epithelial to mesenchymal Tra－ nsitions［J］.Oncogene，2005，24(37):5764

［10］A damson IY，Bowden DH.The type 2 cell as progenitor of alveolar epithelial regeneration a cytodynam ic study in mice after exposure to oxygen［J］.Lab Invest，1974，30(1):35

［11］Li JH，Zhu HJ，Huang XR，et a1.Smad7 inhibits fibrotic effect of TGF－Beta on renal tubular epithelial cells by blocking Smad2 activation［J］.J Am Soc Nephrol，2002，13(6):1464

［12］Ortiz LA，Gambelli F，McBride C，et al.Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and am eli－ orates its fibrotic effect［J］.PNAS，2003，100(14):8407

［13］Theise ND，Hengariu O，Grove J，et al.Radiation pneumonitis in mice:a severe in jury model for pneumocyte engraftment from bone marrow［J］.Exp Hematol，2002，30:1333

［14］Sueb linvong V，Loi R，Eisenhauer PL，et al.Derivation of lung epithelium from human cord blood－derived mesenchymal stem cells［J］.Am J Respir Crit Care Med，2008，177(7):701

［15］Sarugaser R，Lickorish D，Baksh D，et al.Human umbilical cord peri－vascular(HUCPV)cells:a source of mesenchymal progenitors［J］.Stem Cells，2005，23(2):220