細(xì)菌鑒定的分子生物學(xué)方法*

趙鎏莉，王曉萍

(哈爾濱師范大學(xué))

0 引言

自然界中，分布最廣、數(shù)量最多的有機(jī)體是細(xì)菌.它的代謝類型繁多，具有超強(qiáng)的適應(yīng)力，能以有機(jī)物為碳源、氮源，將其充分降解為無機(jī)物.利用細(xì)菌的生產(chǎn)，快速、安全、成本低.目前，細(xì)菌已廣泛應(yīng)用于生態(tài)環(huán)境的修復(fù)、工農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)、食品制造等領(lǐng)域.這幾年，發(fā)達(dá)國家正在努力完善細(xì)菌發(fā)電技術(shù).不久之前，英美科學(xué)家首次精確地展示了細(xì)菌中運(yùn)送電荷的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)［1］.但是致病菌也無時無刻不在危害著環(huán)境中其他生物包括人類的健康.傳統(tǒng)的鑒定方法很難鑒定出種屬之間有相似生理生化特性的細(xì)菌，而且鑒定時間長并且需要使用大量的藥品.隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，研究人員建立了多種完善的分子生物學(xué)鑒定方法.它們可以準(zhǔn)確、快速的對微生物進(jìn)行鑒定，而且大大降低了鑒定成本.因而對細(xì)菌的鑒定方法的總結(jié)顯得十分重要.目前國內(nèi)尚未集中介紹常用的分子生物學(xué)鑒定方法和最新的分子生物學(xué)鑒定方法的研究.筆者將對常用的細(xì)菌鑒定方法:基因序列同源性分析鑒定法、基于PCR的指紋圖譜鑒定法、核酸雜交鑒定法和一些應(yīng)用于細(xì)菌鑒定的最新的分子生物學(xué)方法進(jìn)行總結(jié)，希望能為國內(nèi)的細(xì)菌鑒定工作者提供參考.

1 基因序列同源性分析鑒定法

基因序列的同源性分析是一種PCR技術(shù)與測序技術(shù)相結(jié)合的方法.測序的結(jié)果通過與BLAST中已知的序列的比對，分析出同源性，達(dá)到鑒定的目的.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR(Polymerase Chain Reaction)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，最早是Khorana于1971年提出的設(shè)想.美國科學(xué)家Kary Mullis等在1985年實(shí)現(xiàn)了這一夢想，發(fā)明了對生物學(xué)發(fā)展具有強(qiáng)大推動力的 PCR技術(shù)［2］.它的原理類似于自然界中DNA復(fù)制過程，它的特異性來源于與靶序列兩端互補(bǔ)的引物.測序技術(shù)從70年代末發(fā)展至今，已經(jīng)有化學(xué)修飾法、Sanger雙脫氧鏈末端終止法、高通量測序技術(shù)、MPSS和454焦磷酸測序等多種方法.但目前應(yīng)用最多的還是雙脫氧鏈末端終止法和化學(xué)降解法.

1.1 16s rDNA基因序列同源性分析

它是目前應(yīng)用最為廣泛，也是最早應(yīng)用到細(xì)菌鑒定的分子生物學(xué)方法.細(xì)菌的16s rDNA在細(xì)菌的進(jìn)化中具有高度的保守性，被認(rèn)為是細(xì)菌分子的“活化石”.但也存在著九到十個變異區(qū)，使得不同種屬的細(xì)菌間有著一定的差異.這也就成了細(xì)菌分類的標(biāo)志.目前，幾乎所有已知細(xì)菌的16s rDNA序列都已經(jīng)被測定，并被載入基因庫.

16s rDNA基因序列同源性分析的過程分為:(1)16s rDNA的提取;(2)選擇通用引物或設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行 PCR;(3)測序;(4)與BLAST中已有序列進(jìn)行比對.但是由于需要對16s rDNA的全序列進(jìn)行測序，所以測序周期長，測序費(fèi)用高.

1.2 16～23 s rDNA基因序列同源性分析

由于16 s rDNA的高度保守，所以很難分辨出相近種或同一種內(nèi)的不同菌株.16～23 s rDNA間隔區(qū)(ITS)是位于16 s rDNA與23s rDNA之間的區(qū)間序列.它的進(jìn)化速度是16 s rDNA的10倍，該區(qū)間經(jīng)常有序列的缺失和插入，造成不同種和同種不同菌株的16～23 s rDNA間隔區(qū)(ITS)在數(shù)目、長度和序列組成上的差異性［3］.所以這些年來，也受到廣泛的關(guān)注.ITS區(qū)的分析方法與16 s rDNA一樣，引物則根據(jù)16 s rDNA的下游和23 s rDNA的上游的保守區(qū)設(shè)計(jì).Anu Tilsala等人首先利用這種方法，來對菌株進(jìn)行鑒定，目前在臨床和流行病學(xué)上應(yīng)用非常廣泛［4］.

2 基于PCR的指紋譜圖鑒定法

2.1 PCR-RFLP/T-RFLP

限制性片段長度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析是最早以DNA指紋圖譜為基礎(chǔ)的微生物鑒定方法.它是用限制性內(nèi)切酶對細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行切割，然后通過電泳分離，利用指紋圖譜來檢測基因組中限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的變化，從而比較出不同基因組之間的核苷酸差異，以顯示不同菌種基因組DNA的限制性片段長度多態(tài)性.它用于細(xì)菌種間及種內(nèi)株間的分型鑒定［5］.

由于RFLP產(chǎn)生的DNA指紋圖譜的復(fù)雜性，在分析菌群時費(fèi)時費(fèi)力，且需要克隆基因探針，而且對DNA的量和純度有很高的要求，所以此技術(shù)經(jīng)常與PCR技術(shù)結(jié)合，即PCR-RFLP技術(shù).此技術(shù)可簡化圖譜的帶型，易于分析.

該技術(shù)的步驟為:(1)提取DNA;(2)根據(jù)rDNA的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物;(3)有選擇性的PCR;(4)用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切;(5)用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，產(chǎn)生限制性片段;(5)進(jìn)行指紋圖譜分析，根據(jù)片段的大小、標(biāo)記片段種類和數(shù)量的不同，對細(xì)菌經(jīng)行鑒定.

張旋等人檢測了204份體液標(biāo)本，結(jié)果與培養(yǎng)法相比，其靈敏度、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為 95.7%、88.6%、88.0% 和99.4%［6］.說明 PCR-RFLP 在菌種鑒定中具有高特異性、高敏感性、快速性、準(zhǔn)確性等特點(diǎn).近些年來，PCR-RFLP已經(jīng)廣泛的應(yīng)用到了細(xì)菌的鑒定中［7-9］.

末端限制性片段長度多態(tài)性(T-RFLP)是用熒光染料對PCR引物的5＇端進(jìn)行標(biāo)記，再用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，然后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳或毛細(xì)管電泳分離，再用熒光檢測儀對標(biāo)記片段的大小、種類和數(shù)量進(jìn)行檢測，最后用Gene Scan軟件進(jìn)行分析.該方法降低了圖譜的復(fù)雜性，使得結(jié)果易于分析，重復(fù)性好.Thies FL等人利用此法鑒定出1個屬的23個種的細(xì)菌［10］.T-RFLP不僅可對已知菌進(jìn)行鑒定，還能發(fā)現(xiàn)未知菌.

2.2 隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性

隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)又稱隨機(jī)引物 PCR.RAPD是建立于PCR基礎(chǔ)之上的分子標(biāo)記技術(shù)，基本原理是利用一個隨機(jī)引物(8～10個堿基)通過PCR非定點(diǎn)地?cái)U(kuò)增DNA片段，然后用凝膠電泳分離擴(kuò)增片段來進(jìn)行DNA多態(tài)性研究［11］.這樣就發(fā)現(xiàn)了菌種之間DNA的變異片段數(shù)量和大小的不同.RAPD技術(shù)不僅可以在種間、亞種間甚至還能在同一亞種的不同菌株間進(jìn)行鑒別.而且還能應(yīng)用于未知菌株快速鑒定和流行病學(xué)調(diào)查.Kullen等人采用RAPD對分離于人體內(nèi)的各種雙歧桿菌進(jìn)行鑒別［12］.國內(nèi)方面，鄧海平等人對甘肅地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌進(jìn)行了RAPD 分型［13］.

該技術(shù)的步驟為:(1)細(xì)菌基因組DNA提取;(2)PCR引物選擇或設(shè)計(jì);(3)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物;(4)指紋譜圖分析.

由于RAPD使用的是隨機(jī)引物，而且引物具有通用性，這可以極大地減少費(fèi)用和節(jié)省時間，所以可以應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)和商品化.另外RAPD技術(shù)容易操作，檢測周期短，且反應(yīng)程序可以實(shí)現(xiàn)自動化.因而，在大規(guī)模生產(chǎn)中，RAPD的優(yōu)越性是無可比擬的.

2.3 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)，也稱限制片段選擇擴(kuò)增技術(shù)(Selective restriction fragment amplification，SRFA).AFLP利用兩種以上的酶，一種是常用切割酶，一種是罕見切割酶，切割后的DNA形成不同的限制酶切片段.然后在得到的酶切片段上加人工接頭，以其作為模板進(jìn)行擴(kuò)增.對引物修飾后，實(shí)現(xiàn)了選擇性擴(kuò)增，使一個樣本出現(xiàn)特定的DNA帶譜，而另一個樣本可能無此帶譜.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變形聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，就顯示出了擴(kuò)增片段長度多態(tài)性.它兼具了RAPD和RFLP的優(yōu)點(diǎn)，有比較高的穩(wěn)定性，而且AFLP標(biāo)記比RFLP、RAPD標(biāo)記更為可靠，可有效地揭示微生物多態(tài)性.使得研究人員不僅可以利用它鑒別微生物不同屬的物種，甚至還可以鑒別出同一種屬，不同菌株間的差異.Hopkins KL等人采用熒光素標(biāo)記，即熒光素標(biāo)記的擴(kuò)增片段長度多態(tài)性，已經(jīng)鑒定出尿路菌、大腸埃希菌、空腸彎曲菌和不動桿菌［14］.在國內(nèi)，AFLP已經(jīng)廣泛的應(yīng)用到釀酒菌的鑒定和生產(chǎn)過程的監(jiān)控中［15-16］.

該技術(shù)的步驟為:(1)DNA的提取及純化;(2)DNA的修飾及模板的制備;(3)AFLP反應(yīng);(4)PCR產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析;(5)放射自顯影及分析.

2.4 PCR-SSCP

PCR-SSCP，即 SSCP(Single Stranded Conformation Polymophism，單鏈構(gòu)象多態(tài)性)與PCR結(jié)合分析.DNA單鏈構(gòu)象具有多態(tài)性，堿基序列的不同，影響了其空間構(gòu)象.因此在電泳上的遷移率也不同.SSCP可將長度相同但堿基排列不同的片段區(qū)分開.該方法靈敏度極高，能檢測到一個堿基的差異.由于PCR-SSCP技術(shù)的靈敏快速、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，國內(nèi)外很多研究人員將其應(yīng)用于細(xì)菌、真菌等多種微生物的鑒定研究中，并得到了很好的效果［17］.

該技術(shù)的步驟為:(1)DNA的提取及純化;(2)PCR擴(kuò)增;(3)先將特異的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性，再迅速復(fù)性，成為具有一定空間結(jié)構(gòu)的單鏈DNA分子;(4)用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對單鏈DNA分子進(jìn)行分離(5)放射自顯影及分析.

3 核酸雜交鑒定法

利用堿基互不配對原理，人工的對兩條不同來源的單鏈核酸進(jìn)行復(fù)性，構(gòu)建出新的雜交雙鏈.用這種方法可以進(jìn)行DNA-DNA，DNA-rRNA，rRNA-rRNA分子間的雜交.核酸雜交是測定核酸分子同源性程度和不同物種親緣關(guān)系的有效手段.

3.1 DNA-DNA/DNA-rRNA 雜交

DNA-DNA分子雜交的方法很多，常用的是直接法.就是把待測菌株的雙鏈DNA先解鏈成單鏈DNA，把它固定在硝酸纖維素濾膜或者瓊脂等固相支持物上，然后把它放入含有經(jīng)同位素標(biāo)記的、酶切并解鏈過的參照菌株的單鏈DNA液中.在適宜的條件下，在膜上復(fù)性，構(gòu)建成雜交雙鏈DNA.通過檢測雜合DNA的放射性強(qiáng)度，計(jì)算出被測組與參照組的相對放射強(qiáng)度值，即同源性或相似性強(qiáng)度.DNA-DNA雜交可以在種和屬的層次上鑒定細(xì)菌.但如果兩株菌的關(guān)系比較遠(yuǎn)，它們的DNA不能雜交，這就要研究它們RNA的堿基序列相似性.Deleg等用十幾年時間，用DNA-rRNA雜交方法研究了數(shù)千株不同科屬的400多種菌［18］.Denis Roy等人用這種方法對73株乳酸菌進(jìn)行了鑒定，并確定了它們的親緣關(guān)系［19］.

3.2 熒光原位雜交技術(shù)

熒光原位雜交(FISH)技術(shù)是根據(jù)已知微生物在不同分類層次上種群特異的DNA序列，以熒光標(biāo)記的特異寡聚核苷酸片段為探針，與環(huán)境基因組中的DNA雜交，對環(huán)境中特定微生物種群進(jìn)行鑒定、數(shù)量分析及特異微生物的跟蹤等.

4 其他技術(shù)

多位點(diǎn)序列分析技術(shù)(MLSA).在現(xiàn)代技術(shù)中，研究人員常擴(kuò)增一些編碼特定蛋白的基因來進(jìn)行菌屬中種的鑒定.MLSA技術(shù)主要應(yīng)用的是rpoA基因和 pheS基因［20］，它們分別負(fù)責(zé)編碼RNA聚合酶α-亞基和苯丙氨酰-tRNA合成酶的.通過PCR，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析，采用軟件分析或者進(jìn)行GC含量分析來確定細(xì)菌種屬［21］.

除了rpoA基因和pheS基因兩種常用的基因以外，pmoA和mxaF等編碼結(jié)構(gòu)和功能蛋白質(zhì)的基因可以應(yīng)用到該方法中來對細(xì)菌進(jìn)行鑒定.

5 小結(jié)與展望

細(xì)菌在自然環(huán)境、人類生活和科學(xué)技術(shù)研究中占有舉足輕重的地位，然而我們對它認(rèn)識還相對較少.隨著分子生物學(xué)的不斷進(jìn)步，會有越來越多的細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定方法建立起來.分子生物學(xué)手段和傳統(tǒng)方法的結(jié)合將為細(xì)菌鑒定提供更加準(zhǔn)確、快速、有效的保障，這將極大地為細(xì)菌的研究提供基礎(chǔ).

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