銀屑病患者指甲、鱗屑SDS－電泳圖譜和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的探討

張玉紅，李紅文

（1.河南省開(kāi)封市第一人民醫(yī)院 皮膚科，河南 開(kāi)封 475000；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 皮膚與性病科，河南 鄭州 450052）

銀屑病患者指甲、鱗屑SDS－電泳圖譜和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的探討

張玉紅1，李紅文2

（1.河南省開(kāi)封市第一人民醫(yī)院 皮膚科，河南 開(kāi)封 475000；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 皮膚與性病科，河南 鄭州 450052）

目的探討銀屑病患者指甲、鱗屑SDS－電泳圖譜和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性（Transglutaminase 1，TGase 1）。方法取5例銀屑病患者的指甲、鱗屑與5例健康者指甲、鱗屑，分別提取蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS－PAGE（聚苯乙烯胺凝膠電泳）。應(yīng)用HRP－單丹酰尸胺結(jié)合物對(duì)鱗屑鋪片標(biāo)本檢測(cè)TGase 1酶活性。結(jié)果健康者指甲和鱗屑的SDS－電泳圖譜皆呈現(xiàn)4條主帶：63kDa，54kDa，48kDa及38kDa，銀屑病患者指甲及鱗屑的SDS－電泳圖譜也呈現(xiàn)以上4條主帶，但多數(shù)主帶掃描數(shù)值水平較高，P＜0.05。健康者的鱗屑鋪片標(biāo)本TGase 1酶活性呈現(xiàn)棕黃色細(xì)顆粒，定位于角質(zhì)深層角質(zhì)形成細(xì)胞（keratinocyte，KC）的周緣，相比之下銀屑病患者的TGase 1酶活性缺乏。結(jié)論指甲及鱗屑的SDS－PAGE電泳主帶相似，前者圖譜更清晰，可能與其蛋白較穩(wěn)定有關(guān)；銀屑病患者比健康者的SDS－電泳圖譜主帶表達(dá)水平高，提示其KC可能呈增生狀態(tài)，表達(dá)產(chǎn)物較多；患者TGase 1酶活性的缺如提示其表皮屏障功能有缺陷，可能與其參與代償性增生有關(guān)。

銀屑病，SDS－PAGE；TGase 1酶活性；指甲；鱗屑

銀屑病是最為常見(jiàn)的皮膚病之一，它是一種慢性炎癥性皮膚病，病理變化呈多樣性。銀屑病的病因較復(fù)雜，既有遺傳性因素，也有環(huán)境因素。咽部鏈球菌感染，精神緊張，應(yīng)激反應(yīng)等均可成為該病的誘因。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者［1］對(duì)銀屑病產(chǎn)生的病因進(jìn)行了大量的研究工作，主要從患者的皮損切片中報(bào)道表皮、真皮浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞以及與增殖、炎癥有關(guān)的細(xì)胞因子等。我們?cè)鴪?bào)道［2］，銀屑病皮損切片中有關(guān)細(xì)胞因子和p16基因的突變等，并從魚(yú)鱗病患者剪下的指甲和脫落的鱗屑中探討其表型特征［3］?？紤]到收集剪下的指甲和脫落的鱗屑標(biāo)本對(duì)患者無(wú)損害而易得，故本實(shí)驗(yàn)從銀屑病患者指甲、鱗屑探討其SDS－電泳圖譜、TGase 1酶活性與健康志愿者的差異。關(guān)于這方面研究至今尚未見(jiàn)報(bào)道。

角質(zhì)形成細(xì)胞中的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，也稱(chēng)為Ⅰ型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。最初在培養(yǎng)的分化晚期鱗狀上皮細(xì)胞內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，近年來(lái)已被看作是KC分化標(biāo)志物之一。TGase 1酶是TGase 1基因編碼的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，它是一種交聯(lián)酶，使谷氨酰殘基和賴(lài)氨酸形成穩(wěn)定的交聯(lián)，是形成表皮屏障的KC加厚的細(xì)胞膜套、角化膜套（cornified envelope）的關(guān)鍵酶［4］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)銀屑病患者指甲和鱗屑的SDS－電泳圖譜結(jié)合TGase 1酶活性進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 收集標(biāo)本

收集5例尋常型銀屑病患者（實(shí)驗(yàn)組）和5例健康志愿者（對(duì)照組）的指甲和鱗屑標(biāo)本。銀屑病患者均經(jīng)臨床診斷證實(shí)，且未檢出其他疾病。對(duì)照組平均年齡與實(shí)驗(yàn)組具有可比性。

1.2 提取總蛋白質(zhì)

將所取指甲和鱗屑標(biāo)本磨成粉狀，各稱(chēng)量50mg置EP管中，加Trizol試劑（Gibco，US）提取蛋白質(zhì)。

1.3 進(jìn)行SDS－PAGE電泳

以考馬斯亮藍(lán)G－250蛋白測(cè)定法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，進(jìn)行SDS－PAGE電泳。

1.4 進(jìn)行TGase 1酶活性檢測(cè)［5］

首先制備鱗屑鋪片標(biāo)本，在預(yù)先處理過(guò)的玻片上，將干燥的鱗屑鋪開(kāi)，4℃ 晾干；制備辣根過(guò)氧化物酶（HRP）－單丹酰尸胺（H－D）偶聯(lián)物，以過(guò)碘酸活化／氧化HRP，4℃下以1mmol／L醋酸緩沖液透析過(guò)夜，除去多余的NaIO4，4mg單丹酰尸胺（monodansyl cadaverine，Sigma，US）溶于1mL PBS，與活化的 HRP偶聯(lián)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3h，加新配的NaBH4（硼氫化鈉，Sigma，US）0.05mL水液，4℃反應(yīng)2h，還原Schiff堿；TGase1酶H－D染色，A液（0.05mol／L Tris－HCl，pH8.0，10mmol／L CaCl2，體積分?jǐn)?shù)1%BSA 25μL）與B液H－D（1∶1）混合液50μL點(diǎn)片，4℃ 過(guò)夜，DAB顯色，同時(shí)做不加底物培育的陰性對(duì)照，鏡下觀察，照相。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用圖象分析儀掃描灰度均值，SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)，以α＝0.05為檢驗(yàn)顯著性水準(zhǔn)，以P＜0.05為差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

健康者指甲和鱗屑的SDS－電泳圖譜皆呈現(xiàn)4條主帶：63kDa，54kDa，48kDa及38kDa，銀屑病患者指甲及鱗屑的SDS－電泳圖譜也呈現(xiàn)此4條主帶，見(jiàn)圖1、圖2，其中多數(shù)主帶表達(dá)的水平較高，P＜0.05，見(jiàn)表1、表2。

圖1 銀屑病患者與健康者指甲的SDS－電泳圖譜

圖2 銀屑病患者與健康者鱗屑的SDS－電泳圖譜

表1 健康者與銀屑病患者指甲蛋白的電泳圖片掃描灰度均值比較

表2 健康者與銀屑病患者鱗屑蛋白的電泳圖片掃描灰度均值比較

健康人的鱗屑鋪片標(biāo)本TGase 1酶活性呈現(xiàn)棕黃色細(xì)顆粒，定位于角質(zhì)深層角質(zhì)形成細(xì)胞的周緣；銀屑病患者的鱗屑鋪片標(biāo)本僅有1例TGase 1酶活性呈現(xiàn)少量棕黃色細(xì)顆粒，定位于角質(zhì)深層角質(zhì)形成細(xì)胞的周緣，其余均呈現(xiàn)TGase 1酶活性缺乏。相比之下銀屑病患者的TGase 1酶活性缺乏，見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 健康者鱗屑鋪片標(biāo)本（HE，×1000）

圖4 銀屑病患者鱗屑鋪片標(biāo)本（HE，×1000）

3 討論

銀屑病皮損處浸潤(rùn)激活的T（CD＋4）淋巴細(xì)胞，釋放多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子一方面可誘導(dǎo)KC增殖，另一方面可誘導(dǎo)KC產(chǎn)生細(xì)胞間黏附分子（intercellular adhesionmolecule 1，ICAM－1）和化學(xué)趨向性，使表皮呈現(xiàn)增生、角化不全，趨化多形核粒細(xì)胞（PMN）、單核細(xì)胞和T（CD＋4）淋巴細(xì)胞等浸潤(rùn)皮損區(qū)導(dǎo)致炎癥。同時(shí)提示，炎癥細(xì)胞亦可促使微血管迂曲延伸，微循環(huán)不良，導(dǎo)致銀屑病患者KC合成蛋白異常及角化不良。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，指甲和鱗屑的SDS－PAGE電泳主帶相似，而指甲的電泳圖譜比鱗屑的電泳圖譜更清晰一些，可能與指甲內(nèi)蛋白不易降解有關(guān)。銀屑病患者指甲和鱗屑的SDS－電泳圖譜均呈現(xiàn)4條主帶：63kDa，54kDa，48kDa及38kDa，但多數(shù)主帶掃描的數(shù)值比健康人高。已知指甲和鱗屑蛋白質(zhì)主要有66～170kDa大分子量的內(nèi)皮蛋白，54～48kDa分子量的角質(zhì)絲蛋白和38kDa分子量的絲聚蛋白，這3種蛋白皆是KC分化的產(chǎn)物，提示銀屑病患者增生的KC或分化的產(chǎn)物可能較多。

銀屑病患者的KC代謝異常，其分化凋亡（角化）不全，有異常表型。有報(bào)道［6］認(rèn)為，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶不但參與形成KC的角化膜套，而且還可交聯(lián)內(nèi)皮蛋白的谷氨酰胺殘基和表皮特異的Ω－羥基神經(jīng)酰胺形成酯鍵，參與形成KC之間的脂質(zhì)膜套，這2種膜套是表皮屏障和表皮細(xì)胞相互聯(lián)接的物質(zhì)基礎(chǔ)和表皮主要功能的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，銀屑病患者角質(zhì)深層KC的TGase 1酶活性比健康人的缺如，與Nonomura K［7］的報(bào)道相符。提示銀屑病患者的表皮屏障功能有缺陷，可導(dǎo)致代償性增生［8］，呈現(xiàn)脫屑異常，形成較厚的鱗屑，即呈現(xiàn)異常的分化和凋亡。

［1］Ksatelan M，Massari L P，Pasic A，et al.New trends in the immunopathogenesis of psoriasis［J］.Acta Dermatovenerol Croat，2004，12（1）：26－29.

［2］李紅文，雍磊，高歌，等.銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞p16基因微衛(wèi)星雜合性缺失研究［J］.中華皮膚科雜志，2004，37（3）：138－140.

［3］張晨陽(yáng)，李紅文，鄭乃剛，等.板層狀魚(yú)鱗病患者指甲和鱗屑內(nèi)皮蛋白及鱗屑類(lèi)脂的變化［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2008，43（1）：79－81.

［4］Nemes Z，Marekov L N，F(xiàn)esus L，et al.A novel function for transglutaminase 1：attachment of long－chain omegahydroxyceramides to involucrin by ester bond formation［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96（15）：8402－8407.

［5］楊利國(guó)，魏平華，胡少昶，等.酶免疫測(cè)定技術(shù)［M］.南京：南京大學(xué)出版社，1998：204－211.

［6］Boeshans K M，Mueser T C，Ahvazi B.A three－dimensional model of the human transglutaminase 1：insights into the understanding of lamellar ichthyosis［J］.Jmol Model，2007，13（1）：233－246.

［7］Nonomura K，Yamanishi K，Hosokawa Y，et al.LoCalization of transglutaminase 1mRNA in normal and psoriatic epidermis by non－radioactive in situ hybridization［J］.Br J Dermatol，1993，128（1）：23－28.

［8］Kuramoto N，Takizawa T，Matsuki M，et al.Development of ichthyosiform skin compehsates for defective permeability barrier function in mice lacking transglutaminase 1［J］.J Clin Invest，2002，109（2）：243－250.

［責(zé)任編輯 時(shí) 紅］

Discussion on the SDS－PAGE map and TGase 1 activity in trimmed nails and epidermal scales of the patients with psoriasis

ZHANG Yu－h(huán)ong1，LI Hong－wen2（1.Dermatological Dept.of the First People＇s Hospital of Kaifeng City，Kaifeng，Henan 475000，China；2.Dept.of Dermotopathy and Sexual Diseases of the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou，Henan 450052，China）

ObjectiveTo examine the SDS－PAGE map and TGase 1activity in the trimmed nails and epidermal scales of the psoriasis patients.MethodsThe trimmed nails and epidermal scales were collected respectively from 5cases of psoriasis patients and 5healthy volunteers.The SDS－PAGE was performed by the extracted protein from both nails and scales.The TGase 1activity was detected in the spread scale specimen by using HRP－dansylcadaverine conjugate.ResultsThere were 4major bands，including 63kDa，54kDa，48kDa and 38kDa found in the nail or scale SDS－PAGE map from both psoriasis and healthy cases.In comparison of the psoriasis SDS－PAGE map with the healthy cases，the scanning value in most of the 4major bands was high，P＜0.05.In the healthy specimen the TGase 1activity appeared brownish－yellow colored granules localized in the border of the deeper keratinocytes；while the TGase 1activity was paucity in the psoriasis cases.ConclusionThe results of the nail SDS－PAGE and the scale SDS－PAGE were similar in spite of the former with more distinct map，which may be associated with more stability of the protein contained in the nail.The expression level of the major bands in the psoriasis SDS－PAGE was higher than that in the healthy，suggesting the proliferatiing keratinocytes rich in cell products in the psoriasis cases.The TGase 1activity in paucity suggests that the psoriasis cases may have defective epidermal barrier function.

Psoriasis；SDS－PAGE；TGase 1activity；Trimmed nail；Epidermal scale

R758.63

A

1672－7606（2012）02－0124－04

2011－12－17

張玉紅（1970－），女，河南 開(kāi)封 人，主治醫(yī)師，從事皮膚與性病科臨床工作。