NO、CO和H2S與缺血性腦損傷關(guān)系研究進(jìn)展

彭雪梅 綜述，晏 勇 審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 400016)

20世紀(jì)80年代以后學(xué)者相繼發(fā)現(xiàn)動物和人體內(nèi)也存在一定濃度的一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)和硫化氫(H2S)等氣體。這些氣體分子可由生物體自身合成,均具有神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)作用，它們的生物作用有所不同,但可以單獨或者聯(lián)合的形式,在多個系統(tǒng)及其多種疾病的生理及病理過程中起調(diào)節(jié)作用。它們的產(chǎn)生及傳感機(jī)制引起了學(xué)者的興趣。中風(fēng)已成為中老年人致殘的主要原因并成為世界第3大死亡原因[1]。在缺血性中風(fēng)的發(fā)生、發(fā)展過程中，發(fā)現(xiàn)NO 、CO和H2S均參與其中。本文就這3種氣體信號分子在缺血性腦損傷中的作用及相互關(guān)系的研究進(jìn)展作一綜述。

1 NO與缺血性腦損傷

在鳥氨酸循環(huán)過程中,一氧化氮合酶(NO synthase，NOS)催化L-精氨酸胍基末端的氮原子與分子氧結(jié)合形成一種自由基氣體，即內(nèi)源性NO。NOS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛存在，多位于大腦皮質(zhì)、海馬CA1和CA3區(qū)、杏仁核、紋狀體。NOS活性因所在部位不同而明顯不同，活性較高的NOS存在于大腦皮質(zhì)灰質(zhì)中,無活性或活性低下的NOS存在于白質(zhì)中。目前，已知的NOS有3種亞型：內(nèi)皮細(xì)胞型NOS(eNOS),它定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞，在血管舒張中起作用;誘導(dǎo)型NOS(iNOS),它定位于免疫細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，負(fù)責(zé)巨噬細(xì)胞的活化作用;神經(jīng)元型NOS(nNOS),它定位于神經(jīng)元，涉及神經(jīng)元細(xì)胞信號傳遞。eNOS和nNOS稱為結(jié)構(gòu)型NOS(cNOS)，在病理條件下因鈣通道開放鈣離子內(nèi)流,細(xì)胞內(nèi)的鈣離子增加被激活產(chǎn)生NO，最初NO具有神經(jīng)保護(hù)作用,隨著持續(xù)刺激產(chǎn)生大量的NO具有神經(jīng)毒性作用。iNOS不依賴鈣離子，在免疫激發(fā)和神經(jīng)元損傷時，iNOS激活持續(xù)產(chǎn)生大量的NO發(fā)揮細(xì)胞毒性。

過去的研究表明在腦缺血性再灌注損傷中NO具有神經(jīng)保護(hù)[2]及神經(jīng)細(xì)胞毒性雙重作用。在腦缺血的極早期階段(小于2 h)，eNOS被激活產(chǎn)生NO和NOx，在10 min達(dá)到高峰期，在60 min逐漸恢復(fù)到基線水平。NO作為血管舒張因子對腦缺血神經(jīng)元實施神經(jīng)保護(hù)作用[3],其機(jī)制包括：(1)NO擴(kuò)張腦血管改善微循環(huán)，減輕缺血半暗帶的損傷[4]。(2)NO能夠亞硝化氧化還原劑巰基,N-甲基-L-門冬氨酸(NMDA)受體毒性因二硫鍵形成，鈣離子內(nèi)流被抑制而減輕。(3)NO與活性氧基團(tuán)反應(yīng)，減輕了腦缺血時自由基對神經(jīng)元的炎性反應(yīng)[5]。隨著腦缺血時間延長,由eNOS來源的NO的神經(jīng)保護(hù)作用消失，而代之以nNOS及iNOS來源的NO發(fā)揮其神經(jīng)毒性作用,包括：(1)NO與氧自由基迅速結(jié)合生成過氧亞硝酸陰離子(ONOO-)，其降解物NO2-可造成細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸及脂質(zhì)膜的損傷。 (2)NO可損傷線粒體酶系統(tǒng)抑制能量合成[6]。(3)NO通過抑制核苷酸還原酶(即DNA合成限速酶)及堿基脫氨基作用抑制DNA的復(fù)制及損傷DNA,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7]。(4)NO濃度升高可導(dǎo)致微循環(huán)衰竭,細(xì)胞組織炎癥反應(yīng)，加重腦損傷。

2 CO與缺血性腦損傷

哺乳動物內(nèi)源性CO是血紅素氧化酶(heme oxygenase，HO)降解血紅素大量產(chǎn)生的一種氣體，同時產(chǎn)生二價鐵(Fe2+)和膽綠素。這反應(yīng)是通過煙酰胺腺嘌呤(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate， NADPH)和細(xì)胞色素P450還原酶 (cytochrome P450 reductase)供應(yīng)電子給O2完成的。HO是血紅素降解反應(yīng)的起始酶和限速酶，在體內(nèi)分布廣泛。HO-l為誘導(dǎo)型，在應(yīng)急狀態(tài)下可表達(dá)激活起抗氧化作用，主要分布于脾臟、肝臟、骨髓和網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞。HO-2為結(jié)構(gòu)型，無誘導(dǎo)性，是生理狀態(tài)下的主要存在形式，主要分布于腦和睪丸中。HO-3分布于脾臟、胸腺、前列腺、心臟、腎臟和睪丸，其活性很低，可能對血紅素依賴的細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白具有調(diào)節(jié)作用。

HO/CO系統(tǒng)是神經(jīng)血管調(diào)節(jié)器，研究表明缺氧缺血時腦內(nèi)HO-1表達(dá)增強(qiáng)，降解血紅素導(dǎo)致血漿CO水平顯著增高。更多的證據(jù)表明CO是依賴BKCa通道活性激活，調(diào)節(jié)血管平滑肌擴(kuò)張血管，增量調(diào)節(jié)腦血流量，降低血液的黏附性，對腦組織的缺血缺氧狀態(tài)得到改善，從而起保護(hù)作用[8]。Imuta等[9]研究表明缺氧缺血4 h時腦內(nèi)HO-1表達(dá)增強(qiáng)，血漿CO水平顯著增高，在缺血12 h時達(dá)高峰。產(chǎn)生的CO能活化鳥苷酸，增加環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)，舒張血管平滑肌。韓遵義和楊光田[10]建立大鼠全腦缺血再灌注模型，發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注1 h時HO-1的活性、CO及cGMP含量明顯升高，但海馬CA1區(qū)單位面積神經(jīng)元存活數(shù)目并無明顯減少，推測在病變早期HO-1的活性的升高、CO含量升高是對大腦的保護(hù)作用。但隨著CO增加的高峰期到來，腦血管過度擴(kuò)張,腦血流量灌注過度，可因循環(huán)障礙出現(xiàn)腦水腫加重缺血性腦損傷。

3 H2S與缺血性腦損傷

內(nèi)源性H2S主要由胱硫醚合成酶(cystan thionine synthetase,CBS) 與胱硫醚裂解酶(cystanthionine lyase,CSE) 對含硫氨基酸如L-半胱氨酸(L-cysteine) 的酶解催化產(chǎn)生。CBS是產(chǎn)生內(nèi)源性H2S的主要酶系，是惟一屬于5′-磷酸吡哆醛依賴性酶的血紅素蛋白。在人類它主要分布于大腦和肺部中，其在腦的海馬組織中高度表達(dá)。腦內(nèi)的CBS含有血紅素結(jié)合區(qū)和S腺苷蛋氨酸(S-ademethionine,SAM) 調(diào)控點,其由約551個氨基酸殘基組成。血紅素結(jié)合區(qū)是CBS 的功能性亞基，它主要是負(fù)責(zé)CBS與其作用底物的結(jié)合以及改變和維持CBS的空間結(jié)構(gòu)。SAM調(diào)控點能控制CBS的激活或抑制，它主要通過與SAM結(jié)合改變酶的立體構(gòu)象來完成。CBS活性的調(diào)節(jié)還受Ca2+/鈣調(diào)素的影響，當(dāng)神經(jīng)元受到刺激興奮時,Ca2+內(nèi)流增加,促使鈣調(diào)素結(jié)合并激活CBS，從而增加H2S的生成。

證據(jù)顯示KATP通道是硫化氫作用的核心靶點，KATP通道興奮開放，是硫化氫作用于血管舒張平滑肌細(xì)胞的主要機(jī)制。Hu等發(fā)現(xiàn)格列本脲(KATP抑制劑)可以抑制H2S的舒張效應(yīng)。電生理研究直接證明外源性H2S能增KATP電流，這種作用同樣能被格列本脲抑制[11]。另外，研究發(fā)現(xiàn)NMDA受體可能是H2S的作用位點。近期研究發(fā)現(xiàn)生理濃度的硫化氫具有抗氧自由基的作用[12],能阻止神經(jīng)元避免受興奮性氨基酸(如谷氨酸)、過氧化亞硝基等導(dǎo)致的氧化應(yīng)激。Kimura等發(fā)現(xiàn)H2S能顯著減少氧化應(yīng)激所致的細(xì)胞死亡。任彩麗等[13]研究結(jié)果顯示，缺血再灌注12 h前腦皮質(zhì)組織 H2S含量、CBS酶活性均明顯升高，缺血再灌注24 h時又顯著降低，缺血再灌注48 h恢復(fù)至正常。周銀燕等[14]在實驗中發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注后， CBS-mRNA表達(dá)和H2S生成量在大鼠海馬組織中均增加；應(yīng)用羥氨(CBS抑制劑)預(yù)處理，CBS-mRNA表達(dá)和H2S生成明顯減少，進(jìn)一步進(jìn)行電鏡觀察神經(jīng)細(xì)胞線粒體變形率增高,提示內(nèi)源性H2S在缺血再灌注腦損害中對神經(jīng)細(xì)胞可能有保護(hù)作用。還有研究表明，H2S能降低體溫和代謝率，從而減輕缺血再灌注損傷[15-16]。此外，一定程度的 H2S增高，能夠擴(kuò)張血管，增加供血，起到代償作用。但同時內(nèi)源性H2S過高的表達(dá)，可增強(qiáng)N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體介導(dǎo)的鈣超載而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。

4 NO、CO和H2S在缺血性腦損傷中的相互作用

HO、NOS和CBS是分別產(chǎn)生CO、NO和H2S的酶,也是一種血紅素蛋白。血紅素蛋白分子是NO、CO和H2S氣體分子產(chǎn)生、運輸和傳感的關(guān)鍵載體,并且是氣體分子相互作用的重要場所。血紅素蛋白第一個功能是氣體運輸,有代表意義的就是運輸氧氣(O2)的肌紅蛋白和血紅蛋白。這些含鐵血紅素蛋白質(zhì)有廣泛的配體,其中包括CO、NO及H2S。氣體配體和血紅素之間的結(jié)合是可逆的,在它們的結(jié)合和釋放過程中氣體配體之間進(jìn)行了競爭。血紅素蛋白第2個功能是轉(zhuǎn)移電子,有代表性的就是線粒體的細(xì)胞色素C。這類蛋白傳遞單電子到真核細(xì)胞線粒體呼吸鏈的細(xì)胞膜化合物上。電子的傳遞發(fā)生在非朊基亞鐵血紅素蛋白含鐵部分,使鐵離子轉(zhuǎn)換在2個氧化態(tài):Fe2t和Fe3t。血紅素蛋白的第3個功能是促進(jìn)發(fā)生在特定酶的氧化還原反應(yīng)催化部位的抗氧化反應(yīng)。在這種情況下,血紅素蛋白通過O2和電子氧化或H2O2在非朊基亞鐵血紅素還原反應(yīng)來調(diào)解酶反應(yīng)。加氧酶是可以催化O2作用于酶底物的一類酶,HO和NOS就屬于這類酶。血紅素蛋白的第4個功能是氣體的傳感器。與上述3種功能不同的是,只有位于氣體傳送蛋白功能性亞基中的血紅素蛋白有此作用,血紅素蛋白可以傳遞信號給蛋白的功能區(qū),CBS和sGC屬于這一類酶。盡管HO、NOS和CBS這些酶有自行的途徑識別特定的載體和輔助因子,并避免因氣體類似的極性和配體形狀出現(xiàn)生理混亂,但氣體信號分子間的交互作用確實存在。在腦缺血過程中，缺血后氧化應(yīng)激可導(dǎo)致HO-1/CO、iNOS/NO和CBS/H2S系統(tǒng)的激活，CO、NO和H2S大量產(chǎn)生，三者均參與缺血性腦損傷的病理生理過程，它們相互促進(jìn)或相互抑制，形成一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

4.1HO-1/CO與iNOS/NO相互關(guān) 在缺血性腦損傷早期，HO-1活性增強(qiáng)作用于血紅素產(chǎn)生CO，CO作用于血管平滑肌擴(kuò)張血管，增量調(diào)節(jié)腦血流量，降低血液的黏附性，對腦組織的缺血缺氧狀態(tài)得到改善。同時CO彌散入血與細(xì)胞胞漿中鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)血紅素基團(tuán)上的Fe2+結(jié)合，形成CO-亞鐵血紅素配位復(fù)合體而激活，催化三磷酸鳥苷(GTP)生成環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)；cGMP作為第二信使可促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，激活Ca2+依賴性的eNOS ，產(chǎn)生NO，NO可激活可溶性GC，增加cGMP，舒張血管平滑肌。神經(jīng)元損傷后,iNOS不依賴Ca2+自行激活持續(xù)產(chǎn)生大量的NO發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞毒性作用,NO在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)激活鳥苷酸環(huán)化酶，引起cGMP合成的增加，cGMP激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2/P90RSK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)神經(jīng)元發(fā)生凋亡[17-18],是缺血性腦損傷中主要機(jī)制。另外，CO可競爭取代結(jié)合在血紅蛋白上的NO，進(jìn)一步釋放出過量NO發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞毒性作用。并在腦缺血晚期，因CO、NO的血管舒張作用,腦血管持續(xù)過度擴(kuò)張，血液淤積血流緩慢，循環(huán)內(nèi)的有效血流量減少，進(jìn)一步加重缺血缺氧性腦損傷。因此，HO-1/CO與NOS/NO系統(tǒng)在腦缺血早期是保護(hù)作用，在腦缺血中晚期可能具有相互促進(jìn)作用，加重了缺血后腦損傷。

4.2iNOS/NO與CBS/H2S相互關(guān)系 在缺血性腦損傷時,iNOS因神經(jīng)元損傷被激活大量產(chǎn)生NO。一些亞鐵血紅素包括曾被認(rèn)定為CO信號傳感器細(xì)胞色素P450，這些酶中的亞鐵血紅素對CO和NO都敏感[19]。因此，作為類似于細(xì)胞色素P450的CBS酶可因NO與其血紅素結(jié)合區(qū)結(jié)合激活,導(dǎo)致H2S生成增加；另一方面CBS酶可因缺血缺氧直接激活增量調(diào)節(jié)H2S的生成。有人曾提出H2S可抑制NOS的合成[20]。除氣體信號分子調(diào)節(jié)酶的活性外，化學(xué)反應(yīng)也被認(rèn)為參與了調(diào)節(jié)機(jī)制。Whiteman等[21]在實驗中體外培育供體硫氫化鈉(sodium hydrosulfide,NaHS)和NO可形成RSNO,由此推測H2S和NO之間可反應(yīng)產(chǎn)生RSNO；相反地,發(fā)現(xiàn)H2S可以降低GSNO，進(jìn)而釋放NO。但H2S作為一種還原劑，其生成增加又可抑制NO產(chǎn)在還原性環(huán)境中。周銀燕等[14]在實驗中發(fā)現(xiàn)H2S和NO在腦缺血-再灌注后大鼠模型海馬中表達(dá)增加，但應(yīng)用CBS抑制劑后H2S表達(dá)減少而NO表達(dá)明顯增加，證明缺血缺氧可激活iNOS和CBS產(chǎn)生大量的NO和H2S，NO可進(jìn)一步激活CBS增加H2S生成量，H2S生成增加又可抑制NO產(chǎn)生。NOS/NO體系在早期是以eNOS/NO為主，則和CBS/H2S體系在腦缺血早期是保護(hù)作用；在中晚期以iNOS/NO為主則起損害作用，而CBS/H2S 體系對神經(jīng)細(xì)胞起保護(hù)作用，兩體系之間可能是損害與抗損害的關(guān)系。

4.3HO-1/CO和CBS/H2S相互關(guān)系 在缺血性腦損傷早期，缺血缺氧致HO-1和CBS活性增高，進(jìn)一步產(chǎn)生CO與H2S。在活體內(nèi)多項實驗支持CBS是CO的傳感器，CO可以抑制CBS 的活性，減少H2S的生成[22-23]。其機(jī)制可能是CO與CBS結(jié)合替換含硫的配體，抑制了硫化氫生成過程中轉(zhuǎn)硫途徑，減少H2S的過量生成[24]。目前，近期研究發(fā)現(xiàn)CO與CBS血紅素區(qū)的Fe2+結(jié)合可抑制其活性，減少H2S的生成。邵建林等[25]實驗中建立大鼠全腦缺血再灌注模型，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用CBS抑制劑羥氨后大鼠海馬組織CBS mRNA表達(dá)減少，H2S生成減少，GSH含量降低，應(yīng)用HO-1抑制劑鋅原卟啉大鼠海馬組織HO-1 mRNA表達(dá)減少，CO生成減少，但H2S生成增加，GSH含量明顯增高。這表明HO-1/CO和CBS/H2S兩體系對腦缺血再灌注損傷可能有拮抗作用。

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