異性孿生不育研究進(jìn)展

宮昌海，馬 楨，韓春梅，艾布什，胡曉龍，沈 波，孫獻(xiàn)瑩，武延風(fēng)，高慶華*

（1.新疆巴州畜牧工作站，新疆 庫(kù)爾勒 841000；2.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 新疆 阿拉爾 843300；3.新疆畜牧科學(xué)院 新疆 烏魯木齊 830000）

異性孿生不育研究進(jìn)展

宮昌海1，馬 楨3，韓春梅2，艾布什3，胡曉龍1，沈 波2，孫獻(xiàn)瑩2，武延風(fēng)2，高慶華2*

（1.新疆巴州畜牧工作站，新疆 庫(kù)爾勒 841000；2.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 新疆 阿拉爾 843300；3.新疆畜牧科學(xué)院 新疆 烏魯木齊 830000）

本文綜述了當(dāng)前的異性孿生不育生物學(xué)、診斷和非牛物種發(fā)生狀況的研究。異性孿生胎兒胎盤(pán)間血管發(fā)生聯(lián)系導(dǎo)致XX/XY間性嵌合體，而雌性胎兒生殖器發(fā)生雄性化導(dǎo)致不孕。異性孿生不育是最常見(jiàn)的牛間性形式，偶爾其他物種。建立早期診斷異性孿生不育的新的診斷方法的基礎(chǔ)上檢測(cè)Y染色體DNA片段的聚合酶鏈反應(yīng)較常規(guī)核型分析和臨床檢查顯示靈敏度和效率的改善，異性孿生不育檢測(cè)有較大的經(jīng)濟(jì)重要性。新的異性孿生不育主要在異性孿生嵌合體形成機(jī)理、繆勒氏管抑制物(MIS)抗癌應(yīng)用、移植免疫學(xué)和致突變致畸形研究領(lǐng)域。

異性孿生；不育；研究進(jìn)展

1 異性孿生不育是間性嵌合體

異性孿生不育或自由馬丁 (Freemartin） 是牛最常見(jiàn)的間性嵌合體形式（intersexuality，masculinisation），偶見(jiàn)于其他物種。不使用性控技術(shù)情況下，異性孿生雌性不育是牛和羊生產(chǎn)系統(tǒng)中繁殖多個(gè)后代一個(gè)限制因素[1]。異性雙胎胎盤(pán)血管連接導(dǎo)致XX/XY嵌合體的發(fā)展，并最終有雌性生殖道不同程度間性嵌合體，導(dǎo)致雌性不育[2,3]。影響雄性動(dòng)物的嵌合出生共同雙胞胎的freemartin是有爭(zhēng)議的，主要在是否影響生育，如果生殖細(xì)胞嵌合確實(shí)發(fā)生，是否有任何實(shí)際影響及后代性別比例[1]。

2 異性孿生不育的研究現(xiàn)狀

Tandler和Keller在1911年首先對(duì)牛異性孿生型報(bào)道，并作出正確的解釋，同樣解釋也被Lillie在1916年獨(dú)立發(fā)現(xiàn)。因?yàn)镵eller和Tandler的文獻(xiàn)發(fā)表在獸醫(yī)雜志，沒(méi)有廣泛的傳播，在整個(gè)科學(xué)界的影響較小。Lillie是一個(gè)有影響力的科學(xué)家并且有一群研究生持續(xù)從事這方面的研究工作，他們的論文發(fā)表在”科學(xué)”雜志，而Lillie被認(rèn)為獲得這一發(fā)現(xiàn)，他們陸續(xù)發(fā)表了一些異性孿生方面的研究文章，為脊椎動(dòng)物性別分化研究奠定了基礎(chǔ)[4]。對(duì)異性孿生不育及性別分化的研究主要在形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)三個(gè)方面展開(kāi)，牛的異性孿生為主要的研究模型。

2.1 異性孿生不育組織學(xué)和形態(tài)學(xué)

異性孿生胎兒胎盤(pán)發(fā)育過(guò)程中血管發(fā)生聯(lián)系，產(chǎn)生XX/XY型嵌合體，主要表現(xiàn)是雌性胎兒的生殖器官發(fā)生不同程度變化。Peretti在測(cè)量和觀察牛Freemartins生殖器的結(jié)果顯示[5]，陰戶和陰道的長(zhǎng)度低于正常（分別為6.4 cm和8.1 cm）。 組織學(xué)上，多泡狀性腺存在比正常雄性多泡狀性腺有更加纖維狀和較少腺體的組織，子宮變化范圍從發(fā)育不全到正常，子宮內(nèi)膜的腺體減少到正常。 性腺和間質(zhì)細(xì)胞顯示不正常細(xì)胞質(zhì)和核，表明沒(méi)有功能的狀態(tài)。無(wú)分化的性索和豐富的間質(zhì)細(xì)胞是雄化母犢性腺的明顯特點(diǎn)，卵母細(xì)胞未被觀察到，核型分析顯示在所有異性孿生的X-Y的血細(xì)胞嵌合體。

母羊異性孿生中有睪丸樣結(jié)構(gòu)，分別在腹部和腹股溝的位置，性腺組織學(xué)結(jié)構(gòu)有相似曲細(xì)精管和間質(zhì)細(xì)胞，大部分結(jié)構(gòu)源自中腎管（附睪和水泡腺體），部分母羊有小的未分化的性腺，缺乏卵泡或曲細(xì)精管樣結(jié)構(gòu)。雄性型自由馬丁性腺免疫組化染色的 3beta-羥脫氫酶 （3beta–HSD,3beta-hydroxysteroid dehydrogenase）和堿性磷酸酶（AP,alkaline phosphatase）僅限于間質(zhì)細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)，比正常公羊的性腺和染色更廣泛和深入，3beta-HSD和AP中有不明類型的細(xì)胞[6]。

2.2 異性孿生不育激素變化

抗繆勒激素（AMH,anti-mullerian hormone或MIS,mullerian-inhibiting substance）被認(rèn)為是引起異性孿生綜合征主要物質(zhì)，是成長(zhǎng)和分化因子 (TGFbeta)家族的一員，569個(gè)氨基酸的糖蛋白二聚體，AMH由未成熟的塞托利氏細(xì)胞和出生后的卵泡顆粒細(xì)胞分泌[7]。雄性胎兒的AMH在性分化扮演一個(gè)關(guān)鍵角色-導(dǎo)致繆勒氏管退化，引起雌性胎兒卵巢發(fā)育阻礙和雄性化。表達(dá)人的AMH基因鼠生殖細(xì)胞數(shù)字的最大的減少發(fā)生在16 d和誕生之間，當(dāng)多數(shù)卵母細(xì)胞仍然進(jìn)入減數(shù)分裂的細(xì)線期階段，而正常卵母細(xì)胞已經(jīng)到達(dá)了粗線期階段。轉(zhuǎn)基因鼠胎兒的卵巢的芳香化酶活動(dòng)被減少了，AMH高水平削弱間質(zhì)細(xì)胞類固醇分泌[8][9]。

牛26周大的胎兒異性孿生發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性AMH細(xì)胞，異性孿生母牛性腺分泌的AMH，陽(yáng)性反應(yīng)僅限于少數(shù)細(xì)胞分為‘鳥(niǎo)巢’的睪丸索樣結(jié)構(gòu)中，這個(gè)現(xiàn)象支持這種嵌合體起源細(xì)胞由雄性雙胞胎遷移過(guò)來(lái)的，成年異性孿生母牛沒(méi)有任何AMH陽(yáng)性細(xì)胞[10]。在異性孿生母牛確定血漿睪酮，孕酮，抗繆勒激素的濃度來(lái)衡量從出生到青春期雌雄性正常的水平發(fā)現(xiàn)，雄性和異性孿生母犢牛有很高濃度的AMH（超過(guò)700 ng/mL），相反，雌性AMH濃度總是低于120 ng/mL，雄性頭5個(gè)月AMH值保持穩(wěn)定，異性孿生母牛的頭兩個(gè)星期大幅減少達(dá)到正常雌性的水平，這表明AMH起源于雄性雙胞胎。年輕公牛的血漿睪酮濃度趨勢(shì)與AMH相對(duì)，青春期睪酮上升相對(duì)于急劇下降A(chǔ)MH濃度。牛血漿AMH濃度奇高于其他哺乳動(dòng)物，包括人類和鼠，所取得的結(jié)果值得比較內(nèi)分泌功能方面研究[11]。

慢性地表達(dá)MIS在胚胎形成期間的基因改造的母鼠是出生沒(méi)有子宮或輸卵管和卵巢喪失生殖細(xì)胞并且退化，類似雄化牝犢的?？苿?dòng)物的表現(xiàn)型。從非常高M(jìn)IS表達(dá)的基因改造的公鼠被雌性化，可能在雄激素生物合成的改變。MIS介導(dǎo)的繆勒氏管管退化通過(guò)間質(zhì)組織間接地發(fā)生，在異性孿生管退化本質(zhì)上由雄性孿生的睪丸生產(chǎn)的AMH決定[12,13]。在鼠胎兒卵巢AMH沒(méi)有觸發(fā)在雄化牝犢性腺發(fā)生在懷孕的早期的睪甾酮生產(chǎn)[14]，雄激素可能從雄性雙胞胎的其他物質(zhì)擴(kuò)散出現(xiàn)而不是從在雄化牝犢雄激素的內(nèi)在生產(chǎn)[15]，在異性孿生中AMH的起源是雌性自身還是雄性睪丸抑或二者間而有之。

2.3 異性孿生不育染色體和分子生物學(xué)研究

胚胎性別分化過(guò)程中雄性激素的關(guān)鍵作用已被闡明，內(nèi)分泌研究的進(jìn)展促進(jìn)我們對(duì)各種各樣間性的認(rèn)識(shí)，例如：雌性生殖器官雄性化和外周組織對(duì)雄激素不敏感。染色體和分子遺傳學(xué)研究使我們能夠定位這些性別分化相關(guān)基因，從而進(jìn)一步認(rèn)識(shí)間性現(xiàn)象發(fā)生的分子機(jī)理[16]。臨床研究異性孿生不育母牛存在盲端陰道和原始卵巢和子宮的結(jié)構(gòu)，同時(shí)存在原始包皮，陰莖和睪丸的雄性特征。雄性異性孿生不育，盡管存在XX細(xì)胞，有正常的雄性形態(tài)和外生殖器，其中一些有繁殖力。在這些個(gè)體的染色體脆弱的檢測(cè)染色體畸變（CA：gaps,chromatid breaks and chromosome breaks）和姐妹染色單體交換（SCE,sister chromatid exchange），表現(xiàn)出較高比例的非整倍體細(xì)胞，在染色體畸變與對(duì)照組相比存在統(tǒng)計(jì)差異平均值差異[17]。一般認(rèn)為染色體脆弱影響牛的繁殖性能，對(duì)異性孿生或有過(guò)乏情或流產(chǎn)的牛淋巴細(xì)胞培養(yǎng)和長(zhǎng)臂的X染色體測(cè)定，發(fā)現(xiàn)斷點(diǎn)主要是在長(zhǎng)臂中段（X=0.52;Sigma=0.046），G帶負(fù)染區(qū)長(zhǎng)臂3區(qū)域[18]。而異性孿生不育的分子生物學(xué)研究主要在該癥狀的快速和早期診斷方面[19]。

2.4 其他動(dòng)物的異性孿生不育

在牛上，幾乎所有的異性孿生的母犢都是自由馬丁，而對(duì)綿羊異性孿生不育的發(fā)生率很低。Brace等在對(duì)230個(gè)Rideau Arcott羊后代的血液基因組用SRY基因片段PCR擴(kuò)增，只有10只存在雄性特異性基因被判定為自由馬丁。進(jìn)一步的PCR和FISH分析證實(shí)嵌合體公羊和母羊都存在異性細(xì)胞，對(duì)于母羊雄性細(xì)胞轉(zhuǎn)移嵌合于非血細(xì)胞的組織中。SRY與AMH在母羊性腺中轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而雌性XIST基因在嵌合體公羊的白細(xì)胞中有轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，Rideau Arcott后代中性染色體嵌合比例約為4.35%，沒(méi)有顯著影響后代的性比率，嵌合體綿羊異性細(xì)胞可以遷移至非外周血組織中并且表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活性[20]。而相反性別細(xì)胞染色體兩雄一雌三個(gè)成年絨猴，推斷此嵌合狀態(tài)由胎兒胎盤(pán)異性雙胞胎之間吻合導(dǎo)致[21]。在結(jié)合臨床和細(xì)胞遺傳學(xué)分析意大利南部水牛異性孿生的研究中[22]，42頭動(dòng)物血細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)10個(gè)異性孿生，8個(gè)雌性中6個(gè)顯示正常陰道和陰蒂形態(tài)，2個(gè)出現(xiàn)了一些雄性特征（緊骨盆）。兩個(gè)雄性是正常的。5個(gè)雌性被直腸觸診和3個(gè)雌性直接觀察交配后發(fā)現(xiàn)，內(nèi)部生殖器官?gòu)耐耆狈Γㄩ]鎖陰道）到苗勒氏管發(fā)育不全和沒(méi)有（或萎縮）的卵巢，所有異性孿生雌性不育。鹿[23]和綿羊[3]的表現(xiàn)和生殖行為記錄可以查出一定數(shù)量的行為的反常性，而一致的發(fā)現(xiàn)是所有動(dòng)物都有比正常短的陰道。

3 異性孿生不育診斷

異性孿生的母牛絕大多數(shù)不育，需要加以確定和宰殺。對(duì)間期核進(jìn)行熒光原位雜交程序（FISH）確定牛XX/XY核型嵌合體和標(biāo)志異性孿生的母牛的方法快速，可靠，可用于早期診斷[19]，XX/XY嵌合體核型被染色體組型和FISH雜交分別分析，這些動(dòng)物兩個(gè)分析結(jié)果之間非常相似。目前胚胎性別鑒定試劑盒運(yùn)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）分析性染色體嵌合體異性雙犢，外周血白細(xì)胞用于擴(kuò)增雄性特異性DNA，當(dāng)血液樣本稀釋1:1000時(shí)LAMP反應(yīng)混合物的血紅蛋白或血液凝固不影響濁度測(cè)量反應(yīng)混合物檢測(cè)擴(kuò)增DNA，這一程序可發(fā)現(xiàn)存在的XY白細(xì)胞0.01%的雌性XX血細(xì)胞，胚胎性別鑒定試劑盒可用于敏感的檢測(cè)性染色體嵌合體，使得探測(cè)Y染色體特異DNA在很短的間隔內(nèi)完成（與PCR擴(kuò)增比較），便于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用異性孿生診斷[24,25]。PCR為基礎(chǔ)的測(cè)試有好處超過(guò)雄化母犢診斷當(dāng)前方法[26]。建立牛異性孿生綜合征檢測(cè)XY細(xì)胞的PCR法，正常的血液稀釋血液，Y染色體特異性序列，探測(cè)到濃度為0.1%，PCR方法被認(rèn)為是有效和方便的快速診斷各種不同類型的牛異性孿生綜合征[27]。

診斷懷孕小?；位蛞阉涝诮?jīng)濟(jì)上有巨大好處，E1和E2比P4更好預(yù)斷顯示胎兒在子宮內(nèi)的狀態(tài)和胎兒的數(shù)量的[28]，從牛的雄性胎兒、雌性胎兒和自由馬丁胎兒的血清物質(zhì)，可以推斷死亡或被吸收孿生公牛胎兒導(dǎo)致孿生母犢的雄化性腺[29]。常規(guī)對(duì)血液和染色體分析能夠判斷異性孿生母犢，而建立測(cè)量陰道的長(zhǎng)度的方法可以為小牛提供一種相對(duì)確定的診斷結(jié)論[30]。

4 異性孿生不育需要繼續(xù)研究的問(wèn)題

牛是典型的血液間性嵌合體，而其他物種則不同，探測(cè)確定嵌合體后代體內(nèi)的雄性源細(xì)胞的方法還需要研究和探索。而研究發(fā)現(xiàn)，異性孿生嵌合體可能形成于胎盤(pán)血管吻合前，抗公牛CD34抗原抗體和Y染色體原位雜交分析，自由馬丁牛胎肝存在公牛性造血祖細(xì)胞，表明這種細(xì)胞克隆擴(kuò)增和分化形成于胚胎發(fā)育的早期階段，胎肝造血干細(xì)胞的嵌合顯然在胎盤(pán)血管吻合功能形成之前[31]。

異性孿生不育嵌合體在抗癌臨床應(yīng)用和移植免疫學(xué)，MIS或AMH在異性孿生的分子事件研究有利于其在抗癌臨床應(yīng)用（篩選有卵巢癌的病人和辨認(rèn)表達(dá)感受器官[32]。骨髓移植(BMT，Bone marrow transplantation)導(dǎo)致給造血組織嵌合體，研究異性孿生不育嵌合體模型的抑制免抑反應(yīng)和防止慢性排斥，可以使BMT接收病態(tài)和死亡率減到最小[33]。

異性孿生不育嵌合體可能致突變致畸形[34-40]，表現(xiàn)為器官缺失或發(fā)育不全，如沒(méi)有子宮頸，陰道不發(fā)達(dá)，廣泛的性腺形態(tài)學(xué)改變;沒(méi)有皮質(zhì)缺乏卵巢結(jié)構(gòu)。精漿腺體包括被纖維結(jié)締組織廣泛包圍發(fā)育不全腺體組織但看起來(lái)有管狀結(jié)構(gòu)，或直接表現(xiàn)為畸形，如直腸末端閉鎖，肛門(mén)閉鎖，閉鎖陰道，非性染色體決定性別山羊模型。

輔助生殖技術(shù)如體外受精和胚胎移植，卵泡刺激素誘導(dǎo)排卵及宮腔內(nèi)人工授精和卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)實(shí)施中輔助孵化、細(xì)胞培養(yǎng)和同時(shí)移植的程序都可能增加細(xì)胞融合的機(jī)會(huì)，這種“機(jī)會(huì)假說(shuō)”可以簡(jiǎn)單地解釋非常罕見(jiàn)的雙胎嵌合體，從這個(gè)角度看，對(duì)雙胎的長(zhǎng)期的后續(xù)研究是有必要的[41]。

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[41]Miura K,Niikawa N.Domonochorionic dizygotic twins increase after pregnancy by assisted reproductive technology.JHum Genet,2005,50(1):1-6.

Progress in the Freemartin Syndrome

GONG Chang-hai1,MA Zhen3,HAN Chun-mei2,AIBUSHI3,HU Xiao-long1,SHEN Bo2, SUN Xian-ying2,WU Yan-feng2,GAOQing-hua2
(1.Bazhou Animal HusbandryWorkstation，Koyla 841000,Chana; 2.Collage of Animal Science,Tarim University,Alar 843300,China; 3.Animal Science Academy of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi830000,China)

This review considers the current state of knowledge of freemartin biology,incidence,experimental models,diagnosis,uses for freemartins in cattle herds,occurrence in non-bovine species.Freemartins arise when vascular connections form between the placenta of developing heterosexual twin foeti,XX/XY chimerism develops,and ultimately there ismasculinisation of the female tubular reproductive tract to varying degrees. The freemartin condition represents themost frequent form of intersexuality found in cattle,and occasionally other species.There will be greater economic importance to establish early diagnosis of the freemartin and the detection of the less common single born freemartin.New diagnostic methods based on the detection of Y-chromosome DNA segments by polymerase chain reaction show improved assay sensitivity and efficiency over karyotyping and clinical examination.Potential new research areas are discussed,such as detection of foetal DNA in maternal circulation for prenatal diagnosis,discussion of themechanism of freemartin,application of the anti-tumour properties of Mullerian inhibiting substance (MIS)and investigation of the trans-plantation immunology and teratology.

freemarlin;syndrme;progress

S814.8

A

1003－6377（2012）04－0037-05

2012-07-29

兵團(tuán)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011BD050)；塔里木大學(xué)校長(zhǎng)基金創(chuàng)新群體項(xiàng)目（TDZKCX201201）

宮昌海 （1968-7），男 ，本科，研究方向：家畜育種 。

高慶華（1970-），男，博士，教授，研究方向：動(dòng)物基因工程。