誘導(dǎo)大麥LEA蛋白的抗旱基因及Eibi1基因研究進(jìn)展

周元成 董雙全

(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所，山西 臨汾 041000)

干旱脅迫是作物生產(chǎn)的主要非生物逆境之一，它嚴(yán)重影響農(nóng)作物的品質(zhì)、產(chǎn)量和栽培范圍。通過(guò)挖掘作物自身的抗旱、耐旱機(jī)理，以科學(xué)的手段和方法培育優(yōu)良的耐旱作物品種是從根本上解決這一問(wèn)題的有效途徑。大麥具有早熟、耐旱、耐鹽堿、抗黃矮病等多種優(yōu)良性狀，本文主要介紹大麥耐旱基因即HVA1基因、HDCS1基因、脫水素 (DHNs)、角質(zhì)層基因Eibi1的結(jié)構(gòu)、功能及其誘導(dǎo)和表達(dá)，同時(shí)簡(jiǎn)述大麥抗旱基因在轉(zhuǎn)基因育種工程中的應(yīng)用，并對(duì)大麥抗旱遺傳育種的發(fā)展提出建議。

1 大麥抗旱基因的結(jié)構(gòu)和功能

1.1 脫水素 (DHNs)的結(jié)構(gòu)和功能

LEA蛋白即高等植物胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(Late embryo.genesis abundant proteins，LEA proteins)是種子發(fā)育后期產(chǎn)生的一類(lèi)小分子特異多肽。有研究表明，LEA蛋白可在細(xì)胞層面上保護(hù)植物免受干旱脅迫損傷。脫水素 (Dehydrins，DHNs)是一類(lèi)水溶性脂質(zhì)聯(lián)合體蛋白，屬于第2組LEA蛋白 (LEA D-11)，其共同特征是C-端富含賴(lài)氨酸，由15個(gè)氨基酸組成的保守序列，即EKKGIMDKIKEKLPG(也稱(chēng)K.片段);通常N端有一保守基序Y-片段，二者之間還有一可被磷酸化、由6個(gè)絲氨酸串聯(lián)的S-片段。Egerton-Warburton LM等通過(guò)免疫學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)脫水素在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有分布，這與其他LEA蛋白是不同的。Danyluk等通過(guò)對(duì)小麥的膜系統(tǒng)的研究，認(rèn)為脫水素對(duì)逆境脅迫保護(hù)膜系統(tǒng)穩(wěn)定性至關(guān)重要［1］。Compbell［2-3］等總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)氨基酸序列特征推測(cè)了脫水素的生物學(xué)功能: (1)在非生物逆境脅迫細(xì)胞失水情況下，維持植物細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，(2)細(xì)胞失水滲透壓增高時(shí)，細(xì)胞內(nèi)多余的游離離子將被吸附，減小離子對(duì)植物細(xì)胞的傷害;(3)和其他功能蛋白結(jié)合，在干旱脅迫下維持其他蛋白質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)和功能，保證植物正常生理代謝功能的繼續(xù)。目前在大麥基因組中已描述DHN基因達(dá)13個(gè)，推測(cè)于大麥耐旱相關(guān)最為緊密的脫水素基因?yàn)镈HN4、DHN6。經(jīng)測(cè)定，DHN4位于大麥的第6H染色體上，DHN6位于4H染色體上。DHN4為YSK2型脫水素，其編碼區(qū)長(zhǎng)為678 bp，二級(jí)結(jié)構(gòu)易形成 a-螺旋，通過(guò)SWISS-PROT預(yù)測(cè)DHN4的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示它并沒(méi)有固定的三維結(jié)構(gòu)，這使DHN4能更易于與生物膜結(jié)合從而穩(wěn)定生物膜，防止細(xì)胞內(nèi)水分的過(guò)度流失，維持膜結(jié)構(gòu)的水合保護(hù)體系，防止膜脂雙分子間距減小，進(jìn)而阻止膜融合以及生物膜結(jié)構(gòu)的破壞［1，4］。杜俊波等［5］用 RT-PCR 的方法從青稞中克隆到了脫水素基因DHN4，且通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)，并由此推斷DHN4在青稞的抗旱能力方面起到了重要的作用;DHN6基因序列全長(zhǎng)為1767 bp，含一個(gè)92 bp內(nèi)含子，90～1759 bp為一個(gè)開(kāi)放閱讀框，編碼523個(gè)氨基酸殘基的多肽，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的分子量為49.68 kDa，理論等電點(diǎn)為8.04。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，DHN6具有3個(gè)螺旋區(qū)，無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組分，親水氨基酸比例超過(guò)83%;三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，多肽鏈自身反向平行排列成松散的親水索鏈，K片段參與兼性。螺旋結(jié)構(gòu)域的形成，意味著該脫水素具有束縛自由水、穩(wěn)定細(xì)胞膜相結(jié)構(gòu)的功能。實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，DHN6基因的相對(duì)表達(dá)水平在干旱處理8 h快速累積，推測(cè)DHN6在大麥對(duì)干旱脅迫的早期響應(yīng)中發(fā)揮重要功能［6］。

1.2 HVA1基因的結(jié)構(gòu)和功能

目前國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者對(duì)大麥HVA1基因的表達(dá)與調(diào)控、高同源性序列的克隆以及轉(zhuǎn)HVA1基因植物抗旱性功能驗(yàn)證等方面開(kāi)展了深入廣泛的研究。大麥HVA1基因所編碼的蛋白屬于Lea蛋白的第3組，有研究證明，第3組LEA蛋白在種子成熟，干燥和滲透脅迫條件下可保護(hù)細(xì)胞免受水勢(shì)降低的損傷。HVA 1基因位于大麥的第5條染色體上，編碼區(qū)全長(zhǎng)642 bp，含213個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，富含Ala、Thr、Lys。HVA 1編碼的蛋白質(zhì)包括9個(gè)重復(fù)的不完整的11個(gè)氨基酸組成的保守基元序列:Thr-Glu-Ala-Lys-Gln-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr。其上游啟動(dòng)子區(qū)域含有在ABA誘導(dǎo)基因中保守的序列元件:三個(gè)pABRE序列和C盒。研究發(fā)現(xiàn)，C盒和 pABRE 1突變不會(huì)影響HVA1基因的轉(zhuǎn)錄水平，高水平HVA1基因的表達(dá)依賴(lài)于 pABRE 2 和 pABRE 3［7］。

1.3 HDCS1基因的結(jié)構(gòu)和功能

二棱大麥HDCS1基因編碼202個(gè)氨基酸，含有8個(gè)由11個(gè)氨基酸殘基組成的基序列。與大麥HVA1基因?qū)俑咄葱孕蛄?。將它們的核苷酸序列及其所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示，HDCS1的664個(gè)核苷酸殘基與HVA1相比，HDCS1缺少了C339-C431的33個(gè)核苷酸，同樣也缺少相應(yīng)的Thr122-Ala132的11個(gè)氨基酸殘基，這11個(gè)氨基酸是一個(gè)完整的基元序列。也就是說(shuō)HDCS1比HVA1僅缺少一個(gè)基元序列，其他部分完全相同。HDCS1基元序列呈α-螺旋結(jié)構(gòu)，具有親水親脂兼性，根據(jù)第3組LEA蛋白的結(jié)構(gòu)特征及HDCS1的結(jié)構(gòu)，可以推斷HDCS1是形成第3組LEA蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)［8］。

1.4 角質(zhì)層基因Eibi1

陳國(guó)雄等［9］，以野生大麥和水稻為試驗(yàn)材料，克隆角質(zhì)層基因Eibi1，該基因與葉片角質(zhì)層保水功能密切相關(guān)。角質(zhì)層基因Eibi1編碼ABCG全轉(zhuǎn)運(yùn)子，把角質(zhì)成分從細(xì)胞內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)到葉片表面形成功能性角質(zhì)層。Eibi1基因編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G亞家族的一個(gè)全轉(zhuǎn)運(yùn)子HvABCG31，DNA序列全長(zhǎng)l1693 bp，位于大麥染色體3H上，其表達(dá)主要出現(xiàn)在苗期伸長(zhǎng)區(qū)的幼葉組織中。角質(zhì)層基因Eibi1的抗旱機(jī)理與前文所述基因有所不同，它主要是調(diào)節(jié)葉片表面角質(zhì)層的厚薄來(lái)完成抗旱脅迫功能的。其調(diào)節(jié)機(jī)理如下:Eibi1基因功能的缺失會(huì)導(dǎo)致葉片表皮細(xì)胞中脂質(zhì)成分的大量積累.葉片表面角質(zhì)層變薄，角質(zhì)含量減少，同時(shí)角質(zhì)層結(jié)構(gòu)不完整，葉片失水快，保水抗旱能力差。

2 大麥抗旱基因誘導(dǎo)與表達(dá)

研究顯示，HVA 1基因的表達(dá)與多種因素有關(guān)。在種子發(fā)育期間，HVA1基因的mRNA在糊粉層及開(kāi)花25 d的胚中積累，在干種子的糊粉層中保持較高水平，而在淀粉質(zhì)胚乳細(xì)胞里未檢測(cè)到。這說(shuō)明HVA1基因的表達(dá)受種子發(fā)育水平的調(diào)節(jié)。大麥種子在休眠和未休眠的狀態(tài)下，HVA1 mRNA在干胚里的含量是相同的，但吸脹后，休眠胚HVA1 mRNA下降的速度比未休眠的要慢，打破種子休眠，則導(dǎo)致HVA 1mRNA的消失。這說(shuō)明休眠和水份都對(duì)HVA1基因的表達(dá)有調(diào)控作用。另外，HVA 1基因的表達(dá)還受干旱、NaC1、寒冷或熱處理及ABA等誘導(dǎo)表達(dá)。如Bimei Hong(1992)等人干旱處理24 h或冷處理4 d后HVA1的轉(zhuǎn)錄有很大的提高，但熱處理4 h或1%NaC1處理3 d后轉(zhuǎn)錄水平僅有少量增強(qiáng)［7］。

脫水素 (DHNs)基因的表達(dá)受干旱、NaC1、脫落酸 (ABA)、赤霉素 (GA)、水楊酸 (SA)、茉莉酸 (JA)、傷害、紫外線、重金屬、光周期等因素的調(diào)控［10］。有研究表明，脫水素的表達(dá)累積水平隨著環(huán)境脅迫的時(shí)間延長(zhǎng)而升高。如錢(qián)剛等(2011)［6］通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)大麥Dhn6基因的轉(zhuǎn)錄水平隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)升高。也有研究證明，在大麥發(fā)現(xiàn)13個(gè)脫水素中，并非所有的脫水素基因都被干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)［11］，Tommasini等［12］發(fā)現(xiàn)大麥脫水素 Dhnl、Dhn2、Dhn3、Dhn4、Dhn7、Dhn9和Dhnl0受干旱脅迫后在胚芽，中胚軸和種子根部的表達(dá)量上調(diào)，但不受低溫脅迫;Dhn5、Dhn8和Dhnl3受干旱和低溫脅迫的誘導(dǎo);Dhn6、Dhnl1和Dhnl2既不受干旱也不受低溫脅迫的誘導(dǎo)，它們主要在胚胎中表達(dá)。Choi等發(fā)現(xiàn)Dhnl2基因只在種子發(fā)育成熟過(guò)程中特異表達(dá)，而且，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)。同時(shí)有研究表明，即使相同的LEA蛋白基因在抗旱性不同的大麥參試材料中的表達(dá)累積也有所不同［13-14］，Suprunova等［15］在測(cè)定了大麥離體葉片失水率的基礎(chǔ)上，檢測(cè)了脫水素的早期轉(zhuǎn)錄累積水平，發(fā)現(xiàn)脫水素在抗旱性不同的大麥材料表達(dá)累積也存在差異。這些結(jié)果都說(shuō)明不同的脫水素在應(yīng)對(duì)植物干旱脅迫時(shí)應(yīng)答機(jī)制并不相同，這可能是由于基因的順式作用元件不同而引起的差異。

3 抗旱基因工程育種

HVA1基因具有較強(qiáng)的抗旱功能，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有非常廣泛的應(yīng)用價(jià)值。自1988年Bimei Hong等人發(fā)表大麥HVA 1基因cDNA序列的文章發(fā)表以來(lái)，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者根據(jù)大麥HVA1基因的cDNA序列克隆出其它作物中與其同源性較強(qiáng)的序列，或者把大麥HVA1基因轉(zhuǎn)入其它作物獲得抗旱的轉(zhuǎn)基因植株。除比較早的Deping Xu(1996)、Sivamani(2000)等人通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了轉(zhuǎn)基因植株外，近幾年，冀俊麗 (2002)、劉祥久等(2005)、李楠等 (2007)也都用不同的技術(shù)方法相繼獲得了轉(zhuǎn)基因株系［7，16］，并得到了一定的抗旱效果。國(guó)外也有人將HVA 1基因的cDNA導(dǎo)入到燕麥中，從而獲得了耐旱、耐鹽的轉(zhuǎn)基因燕麥。

二棱大麥 HDCS1的基因、大麥 DHN4和DHN6基因以及角質(zhì)層基因Eibi1三個(gè)抗旱基因方面，由于研究開(kāi)展較晚，且一些抗旱機(jī)理尚不明確或處在推測(cè)階段，它們的轉(zhuǎn)基因利用還未見(jiàn)報(bào)道。

4 展望

提高大麥對(duì)干旱、低溫、鹽堿等非生物脅迫的抗性，改良其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，一直是大麥育種工作的一項(xiàng)艱巨任務(wù)。大麥抗旱基因的發(fā)現(xiàn)與研究對(duì)大麥育種工作意義重大，利用分子遺傳育種技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以獲得抗旱性較強(qiáng)、品質(zhì)較好的大麥品種，大大改善大麥對(duì)環(huán)境不利因素的耐受性，使其可以在干旱的環(huán)境下良好地生長(zhǎng)，從而提高大麥的產(chǎn)量和播種面積。但從目前大麥抗旱基因研究上看，仍存在很多不足之處，如大麥脫水素的具體功能和作用機(jī)理還沒(méi)有統(tǒng)一的認(rèn)識(shí);角質(zhì)層基因Eibi1基因也是新近才發(fā)現(xiàn)，其功能和作用的研究也都是起步階段;大麥抗旱基因在近緣種屬間的遺傳改良和基因誘導(dǎo)、表達(dá)等方面的研究還需不斷深入。隨著大麥抗旱基因研究的發(fā)展，以及植物抗旱分子機(jī)制的研究和生物技術(shù)的日臻完善，大麥抗旱基因?qū)⒌玫礁顚哟蔚拈_(kāi)發(fā)和利用，為抗旱基因工程的研究提供有力的平臺(tái)，也必將為獲得高效的抗旱植株、解決干旱脅迫等問(wèn)題帶來(lái)新的希望。

［1］Danyluk J，Pe-on A，Houde M，Limin A，F(xiàn)owler B，Benhamou N，Sarhan F.Accumulation of an acidic dehydrin in the vicinity of the plasma membrane during cold acclimation of wheat［J］.Plant Cell，1998，10(4):623-638

［2］Compbell SA，Close TJ.Dehydrins:genes，proteins，and associated with phenotypic traits ［J］.New Phytol，1997，137(1):61-74

［3］Porcel R，Azcón R，Ruiz-Lozano JM.Evaluation of the role of genes encoding for dehydrin proteins(LEA D-11)during drought stress in arbuscular mycorrhizal Glycine max and Lactuca sativa plants ［J］.J Exp Bot，2005，56(417):1933-1942

［4］孫 歆，雷 韜，袁 澍，等.脫水素研究進(jìn)展［J］.武漢植物學(xué)研究，2005，23(3):299

［5］杜俊波，席德慧，王尚英，等.青稞脫水素基因Dhn4的克隆與原核表達(dá) ［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版)，2008，45(2):441-445

［6］錢(qián) 剛，平軍嬌，張珍，等.大麥Dhn6基因的克隆、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與干旱脅迫表達(dá)模式 ［J］.遺傳HEREDITAS(Beijing)，2011.33(3):270-277

［7］李 楠，趙玉錦，趙 琦，等.大麥HVA 1基因和LEA蛋白與植物抗旱性的研究 ［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2006(4):25-29

［8］郭衛(wèi)東，饒景萍，徐 炎，李嘉瑞，鄭學(xué)勤.二棱大麥LEA cDNA的克隆與測(cè)序 ［J］.西北植物學(xué)報(bào)，1999，19(3):371-375

［9］陳國(guó)雄等.野生大麥角質(zhì)層基因Eibi1的克隆及其抗旱機(jī)理研究獲進(jìn)展 ［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，14:123

［10］邢 鑫，劉 洋，李德全.植物脫水素的結(jié)構(gòu)和功能［J］.植物生理學(xué)通訊，2010.346(3):268-276

［11］Choi D W，Koag M.C，Close T.J.Map locations of barley Dhn genes determined by gene-specific PCR［J］.Theoretical and Applied Genetics，2000，101(3):350-354

［12］Tommasini L，Svensson J T，Rodriguez E M，et a1.Dehydtin geneexpression provides an indicator of low temperature and droughtstress:transcriptome-based analysis of Barley(Hordeum vulgare L.) ［J］.Funct Integr Genomics，2008，8:387-405

［13］Guo PG，Baum M，Grando S，Ceccarelli S，Bai GH，Li RH，Korff M V，Varshney RK，Graner A，Valkoun J.Differentially expressed genes between drought-tolerant and drought-sensitive barley genotypes in response to drought stress during the reproductive stage ［J］.J Exp Bot，2009，60(12):3531-3544

［14］Qian G，Han ZX，Zhao T，Deng GB，Pan ZF，Yu MQ.Genotypic variability in sequence and expression of HVA1gene in Tibetan hulless barley，Hordeum vulgare ssp.vulgare，associated with resistance to water deficit［J］.Aust JAgr Res，2007，58(5):425-431

［15］Suprunova T，Krugman T，F(xiàn)ahima L Chen G，Shams I，Korol A，Nevo E.Differential expression of dehydrin genes in wild barley，Hordeum spontaneum，associated with resistance to water deficit［J］.Plant Cell Environ，2004，27(10):1297-1308

［16］李 楠，趙 琦，黃 靜，等.六棱大麥HVA1基因在煙草中遺傳轉(zhuǎn)化的研究 ［J］.生物技術(shù)通報(bào)2007，3