益生菌制劑對(duì)早期斷奶仔豬腸道p H、黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)和揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

劉虎傳 張敏紅 李素霞 馮京海 姜海龍 楊家軍 殷瑞娟

腸道是重要的營(yíng)養(yǎng)吸收器官，腸道上皮還是阻止外界環(huán)境有害物質(zhì)入侵機(jī)體的重要屏障。腸道屏障是由腸上皮、上皮間緊密連接及基底膜等構(gòu)成。應(yīng)激損傷腸道屏障功能，導(dǎo)致腸道內(nèi)毒素入侵體內(nèi)。腸道完整性的損傷會(huì)引起腸道通透性的增加，導(dǎo)致從生理到病理炎癥的轉(zhuǎn)變，這也是腸道疾病的一個(gè)重要特征［1］。斷奶應(yīng)激對(duì)仔豬腸道功能的影響一直備受關(guān)注。嚴(yán)汝南［2］報(bào)道3～4周齡仔豬斷奶會(huì)破壞腸道的正常微生物區(qū)系和絨毛結(jié)構(gòu)。斷奶會(huì)引起仔豬的血液生化和免疫指標(biāo)發(fā)生顯著變化，如乳酸脫氫酶活力顯著上升，免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、免疫球蛋白A、總蛋白、白蛋白、球蛋白水平迅速下降［3］。某些血清激素水平及細(xì)胞免疫功能也受到影響，如血清皮質(zhì)醇水平顯著升高，血清甲狀腺素、游離甲狀腺素、生長(zhǎng)激素、胰島素水平顯著降低，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和白細(xì)胞吞噬率顯著降低［4］。因此，改善應(yīng)激條件下仔豬腸道的屏障功能可能為緩解斷奶應(yīng)激提供一種有效途徑。

益生菌是指攝入一定量后能對(duì)宿主產(chǎn)生益生作用的活的微生物［5］。益生菌能改善腸道屏障功能，調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)。Scharek等［6］在仔豬飼糧中添加屎腸球菌能提高早期腸道微生物的定植，降低病原菌的數(shù)量。Lodemann等［7］通過(guò)豬的益生菌作用模型研究，發(fā)現(xiàn)屎腸球菌NCI MB 10415可降低病原菌在健康仔豬腸道中的數(shù)量。Takahashi等［8］發(fā)現(xiàn)在飼糧中添加植物乳桿菌能增加腸道中乳酸桿菌的數(shù)量。Siggers等［9］給新生仔豬飼喂乳酸桿菌和雙歧桿菌的復(fù)合菌，促進(jìn)了有益微生物的定植，能夠降低人工誘導(dǎo)的黏膜萎縮、腸功能性障礙。Collado等［10］發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌能顯著降低沙門(mén)氏菌、大腸桿菌和厭氧芽孢梭菌在豬腸道黏膜上的黏附。大量研究表明，益生菌具有緩解斷奶應(yīng)激的潛力，但其作用機(jī)制并不十分清楚。益生菌的益生功效與它的屬、種和菌株本身有關(guān)。Sanders等［11］研究了不同益生菌屬、種和菌株對(duì)宿主的益生作用，發(fā)現(xiàn)復(fù)合的菌株或菌種比單一菌株更有效。目前，混合不同屬或種的益生菌制劑是一個(gè)研究熱點(diǎn)。關(guān)于益生菌制劑對(duì)早期斷奶仔豬小腸各部位黏膜形態(tài)的影響報(bào)道很少。本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定仔豬腸道p H、黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)和揮發(fā)性脂肪酸含量，探討由屎腸球菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌組成的益生菌制劑對(duì)緩解早期仔豬斷奶應(yīng)激的作用效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

益生菌制劑包含1.6×1011CFU／g屎腸球菌，1.1×1011CFU／g植物乳桿菌和1.3×1011CFU／g枯草芽孢桿菌，所用菌粉購(gòu)自亞芯（南京）生物科技有限公司。

1.2 動(dòng)物與分組

試驗(yàn)選?。?1±2）日齡的初始平均體重為（6.39±0.42）kg“杜×長(zhǎng)×大”三元雜交斷奶仔豬48頭，按性別、體重和窩源基本一致原則，隨機(jī)分為2個(gè)組，每個(gè)組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6頭豬。

1.3 基礎(chǔ)飼糧及飼養(yǎng)管理

參照NRC（1998）5～10 kg仔豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制玉米－豆粕型基礎(chǔ)飼糧，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。試驗(yàn)1組為對(duì)照組，采用基礎(chǔ)飼糧；試驗(yàn)2組為益生菌組，每千克基礎(chǔ)飼糧中添加1×109CFU活菌。試驗(yàn)在河北邢臺(tái)金鳳種豬場(chǎng)進(jìn)行。全封閉豬舍，紅外燈保溫。粉料飼喂，乳頭式飲水器，自由采食和飲水。按照豬場(chǎng)常規(guī)管理程序進(jìn)行免疫驅(qū)蟲(chóng)。試驗(yàn)期為21 d。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（飼喂基礎(chǔ)）Table 1 Co mposition and nutrient levels of the basal diet（as－fed basis） %

1.4 樣品的采集與處理

21、28、35和42日齡時(shí)，從每個(gè)組的每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選取1頭豬屠宰，剪取空腸前1／4段、空腸后1／4段、回腸中段腸管（3 c m），立即測(cè)定腸道內(nèi)容物p H，然后用生理鹽水沖洗凈內(nèi)容物，將腸道組織置于10%甲醛磷酸緩沖液中固定，用于測(cè)定腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)；選擇盲腸結(jié)扎，取出帶有食糜的腸段，測(cè)定內(nèi)容物p H，然后液氮中保存，用于內(nèi)容物揮發(fā)性脂肪酸含量的測(cè)定。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 p H測(cè)定

用雷磁SJ－4 A型p H計(jì)測(cè)定空腸前1／4段、空腸后1／4段、回腸中段和盲腸內(nèi)容物的p H。

1.5.2 腸道黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)測(cè)定

固定后的腸道組織樣品經(jīng)脫水以石蠟包埋，連續(xù)切片（5μm），以蘇木精－伊紅（HE）對(duì)切片進(jìn)行染色。用顯微鏡觀察腸道黏膜結(jié)構(gòu)，并以Motic Med 6.0圖像軟件分析。每張切片測(cè)定10根完整絨毛的絨毛高度和隱窩深度，選擇5張切片計(jì)算每個(gè)組織的平均值。

1.5.3 腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量測(cè)定

HE染色后的5張切片，每張選擇5個(gè)視野對(duì)上皮細(xì)胞和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)表示為每100個(gè)上皮細(xì)胞對(duì)應(yīng)的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量。

1.5.4 腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量測(cè)定

以高碘酸－希夫（PAS）對(duì)杯狀細(xì)胞進(jìn)行染色。選擇5張切片，每張切片選擇5個(gè)視野對(duì)杯狀細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)表示為每100個(gè)上皮細(xì)胞對(duì)應(yīng)的杯狀細(xì)胞數(shù)量。

1.5.5 盲腸內(nèi)容物中揮發(fā)性脂肪酸含量測(cè)定

盲腸內(nèi)容物中乙酸、丙酸和丁酸含量采用Agilent 6890氣相色譜儀測(cè)定，乳酸含量采用戴安CS－3000離子色譜儀測(cè)定。結(jié)果表示為內(nèi)容物每克濕重所含揮發(fā)性脂肪酸的重量（mg／g）。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

用SAS 9.1.3統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性水平表示為P＜0.05。

2 結(jié) 果

2.1 益生菌制劑對(duì)空腸、回腸和盲腸內(nèi)容物p H的影響

由表2可知，28日齡時(shí)，益生菌組回腸內(nèi)容物p H顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；其他日齡益生菌組各腸道組織內(nèi)容物p H有低于對(duì)照組的趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 益生菌制劑對(duì)空腸、回腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞及杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響

由表3可知，28日齡時(shí)，益生菌組空腸絨毛高度和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；35日齡時(shí)，益生菌組空腸絨毛高度和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），隱窩深度顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；42日齡時(shí)，益生菌組空腸絨毛高度、上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），隱窩深度顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

表3 益生菌制劑對(duì)空腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞及杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響Table 3 Effects of pr obiotic preparation on jejunal mucosal morphology and the nu mber of IELs and goblet cells

由表4可知，28日齡時(shí)，益生菌組回腸絨毛高度、上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），隱窩深度顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；35日齡時(shí)，益生菌組回腸絨毛高度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），隱窩深度顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；42日齡時(shí)，益生菌組回腸絨毛高度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

表4 益生菌制劑對(duì)回腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞及杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響Table 4 Effects of pr obiotic preparation on ileal mucosal morphology and the nu mber of IELs and goblet cells

2.3 益生菌制劑對(duì)盲腸內(nèi)容物中揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

由表5可知，28日齡時(shí)，益生菌組盲腸內(nèi)容物中丁酸和乳酸含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；35日齡和42日齡時(shí)，益生菌組盲腸內(nèi)容物中乙酸、丙酸、丁酸和乳酸含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

3 討 論

3.1 益生菌制劑對(duì)斷奶仔豬盲腸內(nèi)容物中揮發(fā)性脂肪酸含量及p H的影響

豬等單胃動(dòng)物的微生物發(fā)酵主要發(fā)生在盲腸、結(jié)腸及直腸部位，其中盲腸揮發(fā)性脂肪酸含量最高［12］。仔豬腸道微生物發(fā)酵碳水化合物可以產(chǎn)生多種揮發(fā)性脂肪酸，主要包括甲酸、乙酸、丙酸和丁酸，另外還可產(chǎn)生大量的乳酸［13］。這些小分子酸對(duì)仔豬腸道的健康起重要作用。H?gberg等［14］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼糧中益生菌含量升高時(shí)，仔豬腸道中揮發(fā)性脂肪酸的含量顯著增加，同時(shí)p H顯著降低。揮發(fā)性脂肪酸含量的升高，可以發(fā)揮抑菌效應(yīng)，增加腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。Giang等［15］在仔豬飼糧中添加益生菌制劑，14日齡和35日齡時(shí)，回腸和結(jié)腸中乳酸和乙酸的含量顯著增加，35日齡時(shí)，回腸中丙酸含量也顯著增加。辛娜等［16］研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌能顯著降低空腸和盲腸的p H。蘇勇等［13］發(fā)現(xiàn)芽孢乳桿菌能顯著提高35日齡仔豬結(jié)腸乙酸、丙酸和丁酸的含量。本試驗(yàn)中，仔豬添加益生菌制劑也得到類(lèi)似的結(jié)果，盲腸內(nèi)容物中乙酸、丙酸、丁酸和乳酸含量上升，而p H有所降低。

表5 益生菌制劑對(duì)盲腸內(nèi)容物中揮發(fā)性脂肪酸含量的影響Table 5 Effects of pr obiotic preparation on volatile f atty acid content in cecal digesta mg／g

3.2 益生菌制劑對(duì)斷奶仔豬空腸、回腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞及杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響

腸絨毛是小腸上皮和固有層共同向腸腔突出形成的細(xì)小突起，可使腸腔的面積擴(kuò)大約10倍，極大地增加了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收面積。一般情況下，隱窩基部的細(xì)胞不斷地分化并向絨毛的端部遷移，形成具有吸收能力的腸上皮細(xì)胞以補(bǔ)充絨毛正常脫落的腸上皮。仔豬斷奶后，腸道黏膜萎縮，腸道黏膜上皮絨毛變短，隱窩變深，腸絨毛成熟細(xì)胞數(shù)量減少［17］。絨毛變短，隱窩變深會(huì)減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，降低動(dòng)物的生產(chǎn)性能。顧憲紅等［18］比較了不同斷奶日齡對(duì)仔豬腸黏膜形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)斷奶日齡越早，仔豬腸黏膜變化越大，其中絨毛高度下降幅度越大，恢復(fù)時(shí)間越長(zhǎng)，一般在斷奶后8～12 d降至最低，隨后恢復(fù)較快。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，益生菌組絨毛高度顯著高于對(duì)照組，隱窩深度也低于對(duì)照組，說(shuō)明益生菌制劑為腸道細(xì)胞提供了較好的保護(hù)作用。

上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞分布于腸道上皮細(xì)胞之間，與基底膜臨近，由多類(lèi)群的T細(xì)胞組成，是機(jī)體與食物和細(xì)菌抗原最早、最頻繁接觸的淋巴細(xì)胞，因而形成了腸道免疫系統(tǒng)的第一道防線。已有研究表明，應(yīng)激可誘導(dǎo)小鼠腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的凋亡［19］，而益生菌能增加腸道中上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量，并 減 少 其 凋 亡［20］。 顧 憲 紅 等［21］研 究 發(fā) 現(xiàn) ，28日齡斷奶仔豬小腸各段上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著高于17日齡、21日齡和35日齡斷奶仔豬，而21日齡斷奶仔豬小腸各段上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著低于其他3個(gè)日齡組。本試驗(yàn)添加益生菌制劑后，斷奶仔豬空腸、回腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量得到了一定的增加。

杯狀細(xì)胞覆蓋于腸道上皮細(xì)胞表面，分泌黏液物質(zhì)，其主要是黏蛋白。黏蛋白是一種糖蛋白，在管腔內(nèi)成為潤(rùn)滑性黏液涂布于腸上皮表面，與柱狀細(xì)胞分泌的復(fù)合糖蛋白一起構(gòu)成腸道黏膜上皮細(xì)胞表面的細(xì)胞衣，而細(xì)胞衣的糖蛋白和細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)牢固結(jié)合，可捕獲微生物，阻擋病原微生物和有害物質(zhì)的破壞，是潛在致病源的重要物理屏障［22］。隨腸段后移，杯狀細(xì)胞也逐漸增多。應(yīng)激時(shí)，腸道杯狀細(xì)胞能快速分泌黏液素以增強(qiáng)腸道的屏障功能，但長(zhǎng)期的慢性應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致杯狀細(xì)胞的枯竭，從而對(duì)后續(xù)應(yīng)激和新應(yīng)激的反應(yīng)能力減弱。斷奶越早、日齡越小的仔豬腸上皮間杯狀細(xì)胞數(shù)量越多［22］。陳旭東［23］研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌能顯著增加斷奶仔豬回腸和盲腸杯狀細(xì)胞的比例。丁酸鈉［22］和復(fù)方中藥制劑［24］等也均能增加仔豬小腸黏膜杯狀細(xì)胞數(shù)量。本試驗(yàn)也得到類(lèi)似的結(jié)果，添加益生菌制劑顯著增加了28日齡回腸和42日齡空腸的杯狀細(xì)胞數(shù)量，表明益生菌制劑有穩(wěn)定杯狀細(xì)胞分泌，提高仔豬免疫力，緩解斷奶應(yīng)激的作用。

4 結(jié) 論

① 添加益生菌制劑能緩解早期斷奶應(yīng)激對(duì)絨毛高度和隱窩深度的影響，提高腸道內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量。

② 添加益生菌制劑能增加盲腸內(nèi)容物中揮發(fā)性脂肪酸含量，降低腸道p H。

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