優(yōu)化高效液相色譜法測定棉籽粕中游離棉酚的含量

陳 來 冷向軍 李小勤＊ 王曉芳 李乃順 周璐穎章樟紅 董 晰 姚勁挺 柴仙琦

飼料蛋白資源的緊缺，使得棉籽粕越來越多地應用于飼料工業(yè)。棉籽粕中含有大量抗營養(yǎng)因子，特別是游離棉酚，成為限制棉籽粕在飼料中大量應用的主要因素。棉酚是一種多酚羥基聯(lián)萘醛類化合物，按其存在形式，可分為游離棉酚和結合棉酚。游離棉酚的活性基團（羥基和醛基）對動物有一定的毒性，主要表現(xiàn)為影響飼料適口性，抑制動物生長，損害雄性動物生殖系統(tǒng)發(fā)育［1－2］；結合棉酚是游離棉酚與氨基酸等化合物結合而成，其毒性較小。為控制動物對游離棉酚的攝入量，《飼料衛(wèi)生標準》（GB 13078—2001）［3］和《無公害食品漁用配合飼料安全限量》（NY 5070—2002）［4］規(guī)定了棉籽餅（粕）及肉用仔雞、生長雞、產(chǎn)蛋雞、生長肥育豬、溫水雜食性魚類、蝦類配合飼料中的游離棉酚的含量。

為合理地利用棉籽粕，對棉籽粕中的游離棉酚含量進行準確測定尤為重要。目前，檢測游離棉 酚 的 方 法 有 分 光 光 度 計 法［5－6］、薄 層 層 析法［7－8］、高 效 液 相 色 譜 （high－perfor mance liquid chro matography，HPLC）法［9－13］等。分光光度計法包括苯胺法和間苯三酚法，其中苯胺法是國家標準《飼料中游離棉酚的測定方法》（GB 13086—91）中采用的方法，這2種方法選擇性不強，與游離棉酚有相似化學結構的物質均能被同時檢出，使得檢測結果偏高，并且操作繁瑣，使用的苯胺等溶劑具有毒性；薄層層析法也具有樣品分離度低、準確度低、溶劑毒性較強、操作繁瑣等不足；HPLC法則具有分離效率高、靈敏度高、準確性高、簡便快速、可自動化檢測等優(yōu)點，具有廣泛的應用前景。但是本實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn)，以95%乙醇－水－乙醚－冰醋酸（體積比為71.5∶28.5∶20∶0.02）為溶劑和提取劑時，提取不徹底，樣品在溶劑中穩(wěn)定性差［9］；以丙酮為溶劑時，穩(wěn)定性好，但目的峰形不佳，出現(xiàn)前延峰，這些均影響了測定的準確度、精密度和靈敏度［10］。因此，本試驗擬從溶劑、提取劑、提取工藝、色譜條件優(yōu)化等出發(fā)，篩選并建立最佳的樣品處理方法和色譜條件，建立快速準確的測定棉籽粕游離棉酚的HPLC方法，為棉籽粕的合理利用提供科學依據(jù)。

（2）完善科研經(jīng)費審計報告。內部審計人員應運用專業(yè)技能對科研經(jīng)費的開支情況進行評價，將科研經(jīng)費管理的具體情況、發(fā)現(xiàn)的問題以及處理建議匯報給單位負責人。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：LC－20 A高效液相色譜儀（日本島津國際貿易有限公司）、DU－800紫外掃描儀（Beconman）、SK－2210 HP超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）、2 XZ（S）－Z型旋片式真空泵（上海德英真空照明設備有限公司）、HNY－200B恒溫搖床（天津市歐諾儀器儀表有限公司）、5810 R離心 機 （Eppendof）、RV10 旋 轉 蒸 發(fā) 儀 （IKA）、CPA－2250電子分析天平（Sartorius）、H－101振蕩器（上海康禾光電儀器有限公司）。

在使用TDR系統(tǒng)進行滑坡的長期監(jiān)測過程中，首先根據(jù)滑坡的實際情況，在滑坡的某個位置鉆孔，打穿潛在滑動面后直至穩(wěn)定的地層，將TDR同軸電纜安放在監(jiān)測鉆孔中。而后，將同軸電纜與電纜測試儀相連，回填鉆孔，將同軸電纜與周圍地層緊密結合(圖6)。接著，把電纜測試儀作為信號源，發(fā)出脈沖電磁波，通過同軸電纜進行傳輸，同時接收從電纜中反射回來的脈沖信號。數(shù)據(jù)記錄儀接到電纜測試儀的上部，記錄、存儲從同軸電纜中反射的脈沖信號，為后續(xù)分析做準備。通過TDR系統(tǒng)確定滑動面位置，對不同深度的滑坡體位移動態(tài)進行記錄分析，定位監(jiān)測對滑坡深部位移，在工程中具很好的應用前景[37-38]。

試劑：乙腈、甲醇均為色譜級（上海安譜有限公司）；磷酸、丙酮、氯仿、乙醚、異丙醇、正己烷、乙醇、四氫呋喃、磷酸鉀、冰醋酸、超純水均為分析純（上海國藥集團化學試劑有限公司）；微孔濾膜（直徑13 mm，孔徑0.45μm，購自上海安譜有限公司）；棉酚標準品為HPLC級（G8761 Sig ma公司），棉籽粕（粗蛋白質含量為47%，粉碎過40目篩）。

0.2 %磷酸緩沖液的配制：用5.0 mL移液管移取2.35 mL磷酸于1 000 mL容量瓶中，用超純水溶解并定容至刻度。

乙腈－0.2%磷酸（體積比為85∶15）溶液的配制：量取150 mL 0.2%磷酸緩沖液于1 000 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度。

同時，快車節(jié)約時間可利用快車斷面客流及越行段的節(jié)省時間得出。以遠期早高峰(見表5)為例，上行方向留仙洞站—上屋北站的斷面客流為5 876 人次/h，快車共運行4個站，節(jié)省4.0 min(按照快車越行1個站節(jié)約1 min的原則)，則快車在上行方向留仙洞站—上屋北站的節(jié)省時間為392 h。以此類推，其余時段及各區(qū)段節(jié)省時間計算方法同上，則早高峰、晚高峰及平峰快車節(jié)省的時間分別為3 710 h、3 358 h、19 894 h。因此，全日快車節(jié)省時間約為2.70萬h。

“早不下晚不下,非趕這個時候下。老天爺,你他媽成心找人別扭啊!”楊秉奎扭動著布滿胡茬的嘴,喃喃地咕噥著。天仿佛就是要跟楊秉奎找別扭似的,霎時間雷聲大作,暴雨傾盆。

1.2 試驗方法

對各種提取劑的提取效果、穩(wěn)定性（表1）和色譜圖（圖2）的分析表明，具有較高提取率的提取劑為：氯仿－乙醇－異丙醇（體積比為40∶40∶20）、丙酮、氯仿－乙醇－乙醚－異丙醇（體積比為40∶40∶10∶10）、氯仿－乙醇（體積比為40∶60）溶液，其中以氯仿－乙醇－異丙醇（體積比為40∶40∶20）溶液的提取率最高，其次為丙酮；對于這4種提取劑，測定棉酚在24 h后的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)棉酚在丙酮中穩(wěn)定性最好；從色譜圖來看，4種提取劑處理樣品的色譜峰都不是很理想，這可能與棉籽粕中存在的大量棉酚衍生物有關，需要經(jīng)過一定的前處理。相比于其他3種提取劑，丙酮處理樣品的色譜峰峰形、分離度、靈敏度相對較好。綜合棉酚提取率、穩(wěn)定性、色譜峰等因素，本試驗選擇以丙酮作為棉籽粕中游離棉酚的提取劑。

稱取棉籽粕樣品3.0 g，置于50 mL離心管中，加 丙 酮 30 mL，40 ℃ 超 聲 30 min，25 ℃3 000 r／min離心10 min，收集上清液于100 mL容量瓶中，重提3次，合并提取液，0.45μm微孔抽濾，旋轉蒸發(fā)，用乙腈－0.2%磷酸溶液溶解并置于50 mL容量瓶，定容至刻度，低溫避光保存，0.45μm微孔過濾，以備上機。

本試驗篩選的最佳提取工藝為：53 k Hz 40℃超聲提取30 min，3 000 r／min 25℃離心10 min，重復提取3次，合并上清液，抽濾，旋轉蒸發(fā)掉丙酮，用乙腈－0.2%磷酸（體積比為85∶15）溶液溶解。此工藝提取徹底，分離度高，靈敏度高，樣品回收率高。

由表2可知，相比于搖床振蕩和浸提的提取效果，超聲提取率高；在超聲提取過程中，提取效率并不隨著時間的增加而增加，而是超聲30 min時效果最好，但進行1次超聲波處理，樣品提取不夠徹底，經(jīng)過3次提取后，樣品中的棉酚提取完全；樣品的提取率隨超聲溫度的升高先升高后降低，當溫度為40℃時，提取率最高，而溫度超過45℃時，提取率反而呈下降趨勢；超聲處理的樣品3 000 r／min離心10～20 min，樣品分離效果均較好，故取10 min。

棉酚標準溶液的配制：精確稱取3.06 mg標準品，置于25 mL的棕色容量瓶中，用乙腈－0.2%磷酸溶液溶解并定容至刻度，配制成濃度為122.4 μg／mL的棉酚標準儲備液，低溫避光保存。

2 結果與討論

2.1 溶劑選擇

在已知棉籽粕樣品提取溶液中添加不同濃度的棉酚標準品溶液，根據(jù)濃度與峰面積成正比的依據(jù)，從而確定目的峰的保留時間。樣品中游離棉酚目的峰的保留時間有時會因流動相的原因而有所偏移，但目的峰與附近雜峰有良好的分離度，不會影響目的峰的確定。

本試驗通過對丙酮、乙醇、甲醇、95%乙醇－水－乙醚－冰乙酸（體積比為71.5∶28.5∶20∶0.02）、異丙醇－正乙烷（體積比為60∶40）、乙腈－0.2%磷酸（體積比為85∶15）溶液等溶劑的比較，發(fā)現(xiàn)棉酚在乙醇、甲醇等溶劑中不穩(wěn)定，在丙酮中容易與丙酮耦合，不利于棉酚在色譜柱中的分離，且峰形不佳，而以乙腈－0.2%磷酸（體積比為85∶15）溶液作為溶劑時，樣品穩(wěn)定性良好，分離效果好，峰形理想，靈敏度高（圖1）。根據(jù)棉酚分子結構可知，第1、6、7位上的羥基比較活潑，容易脫去氫原子，使棉酚在溶劑中呈較強酸性，在溶劑中加入磷酸，可以抵制棉酚分離，提高其穩(wěn)定性。因此，本試驗選擇乙腈－0.2%磷酸（體積比為85∶15）溶液作為棉酚的溶劑。

2.2 提取劑選擇

根據(jù)棉酚在各溶劑中的溶解性，比較多種提取劑（表1）的提取率和對色譜分離效果的影響。

1.2.1 樣品前處理方法

圖1 棉酚標準品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chr o matogr a m of standar d gossypol

表1 不同有機溶劑的棉酚提取率和穩(wěn)定性比較Table 1 Co mparison of different organic solvents f or gossypol extraction rate and stability

2.3 提取工藝選擇

評價提取工藝時，要求提取率高、回收率高，樣品在溶劑中的穩(wěn)定性好，色譜峰分離度高。因此，本試驗在篩選出溶劑、提取劑的基礎上，比較了不同提取工藝（表2）對棉酚分離效果的影響（圖3）。

色譜柱 Agilent TC－C18（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相為乙腈∶0.2%磷酸＝85∶15（體積比），流速1.0 mL／min，紫外檢測波長235 n m，進樣量20μL，柱溫25℃。

圖2 不同有機溶劑提取棉籽粕中棉酚的色譜圖比較Fig.2 Co mparison of different organic solvents f or chro matogram of gossypol extracted fr o m cottonseed meal

表2 不同提取工藝的棉酚提取率比較Table 2 Co mparison of gossypol extraction rates in diff erent extraction processes

圖3 丙酮提取棉籽粕中棉酚蒸發(fā)前、后的色譜圖比較Fig.3 Co mparison of acetone evaporated bef or e and after f or chr o matogra m of gossypol extracted fr o m cottonseed meal

由圖3可見，對丙酮提取的樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)色譜峰峰形不佳，分離度差，而樣品經(jīng)旋轉蒸發(fā)并用乙腈－0.2%磷酸（體積比為85∶15）溶液溶解后，色譜峰峰形良好，分離度高，雜峰干擾小。在溶解蒸發(fā)瓶上的殘渣時，需加30 mL溶劑并超聲溶解，多次潤洗蒸發(fā)瓶以減少樣品損失，確保高回收率。

1.2.2 色譜條件

以測井、巖心和三維高分辨率地震資料為基礎，以高分辨率層序地層理論為指導，運用精細地層劃分和對比技術，將研究區(qū)沙三中、下亞段，分別劃分為6個和3個短期旋回，建立準確的層序地層格架，在此基礎上明確了三角洲沉積模式。

2.4 流動相選擇

隨著流動相中有機溶劑比例的增加，棉酚被洗脫的速度加快，即保留時間變短，但這不利于游離棉酚與其衍生物及其他雜質的分離。為篩選出最佳的流動相并獲得適合的保留時間，本試驗用等度洗脫和梯度洗脫2種方式比較多種流動相組成和比例（表3）對樣品中棉酚分離效果的影響（圖 4、圖5、圖6）。

表3 不同流動相組成和比例對棉籽粕中棉酚分離效果的影響Table 3 Effects of different mobile phase co mponents and their proportion on the separation of gossypol fr o m cottonseed meal

由表3和圖4、圖5、圖6可知，等度洗脫相比于梯度洗脫，目的峰與雜質峰分離良好，峰形理想，保留時間穩(wěn)定；采用等度洗脫方式，以乙腈－0.2%磷酸（體積比為85∶15）溶液為流動相，隨乙腈比例的降低，雜質干擾減小，但峰變寬，靈敏度降低，保留時間延長。綜合分析認為，乙腈與0.2%磷酸的體積比為85∶15時，所得色譜圖峰形良好，分離度高，信號強，靈敏度高，保留時間（約8.30 min）適合。因此，本試驗選擇乙腈－0.2%磷酸（體積比為85∶15）溶液為流動相。

一方面，酒店業(yè)行業(yè)是一種勞動密集型的服務性行業(yè)，普通員工入職都是從基層做起，所以人員錄用的門檻較低，從社會招聘的從業(yè)人員的素質參差不齊，人員的錄用門檻和復雜性在一定程度上決定了飯店業(yè)復雜的工作氛圍，工作氛圍的復雜性造成員工跳槽思想變得正常和隨意化；另一方面，酒店行業(yè)大都有面臨經(jīng)營的季節(jié)性，淡旺季的經(jīng)營差別也致命整個飯店行業(yè)的員工需求彈性較大，有一些酒店不得不根據(jù)淡旺季的員工需求量來安排員工的人數(shù)，人員的經(jīng)常變動也會增加員工的不安全和不穩(wěn)定感，影響到從事飯店業(yè)的人。

圖4 2種流動相等度洗脫的棉酚標準品色譜圖比較Fig.4 Co mparison of t wo kinds of mobile phases f or chr o matogram of gossypol standard with isocratic elution

2.5 目的峰的確定

棉酚呈弱酸性，易溶于甲醇、氯仿等有機溶劑，難溶于水。溶劑對樣品的穩(wěn)定性有一定影響：一些溶劑易與目標物質形成耦合，棉酚在某些溶劑中則容易出現(xiàn)結構變異，如棉酚在氯仿中形成醛式、乙醇酮式、羥基內醚式異構體，其比例為6∶2∶1［14］。因此，選擇溶劑時，應考慮樣品穩(wěn)定性、分離度和安全性。

圖5 不同比例乙腈－0.2%磷酸溶液為流動相等度洗脫時的棉酚（棉籽粕提?。┥V圖比較Fig.5 Co mparison of different mobile phases f or chr o matogram of gossypol that was extracted fr o m cottonseed meal.The mobile phase was an isocratic solvent consisting of 0.2%phosphoric acid in acetonitrile／water.

圖6 以乙腈－0.2%磷酸溶液為流動相，按表3中3種方式梯度洗脫時的棉籽粕色譜圖比較Fig.6 Co mparison of three kinds of elution means（Table 3）f or chr o matogr am of gossypol that was extr acted fr o m cottonseed meal.The mobile phase was a gradient solvent consisting of 0.2%phosphoric acid in acetonitrile／water.

2.6 標準曲線繪制

精密吸取“1.1”項下的棉酚標準儲備液，用乙腈－0.2%磷酸（體積比為85∶15）溶液稀釋，并配制系列濃度的棉酚標準溶液：0.122 4、0.244 8、0.489 6、0.979 2、1.958 4、3.916 8、7.833 6、9.792 0、19.584 0、39.168 0、78.336 0μg／mL，在最佳色譜條件下進行檢測，對峰面積y與濃度x進行線性回歸，得回歸曲線（圖7），其回歸方程為y＝189 347x＋24 969，r＝0.999 99，在線性范圍為0.1224～78.336μg／mL，濃度與峰面積呈良好線性關系；以3倍的信噪比，得其最低定量限為0.52 mg／kg。欒姝等［11］在測定棉籽仁中棉酚的含量中，建立的標準曲線在濃度范圍為1.9～34.9μg／mL，r＝0.999 7；唐輝等［15］在食用棉籽蛋白中總棉酚與游離棉酚含量測定的研究中，建立的標準曲線在線性范圍為2.0～8.0μg／mL，r＝0.999 4；吳偉偉等［10］在測定棉籽餅粕飼料中游離棉酚的研究中，建立的標準曲線在線性范圍為 0.8～54.0 μg／mL，最 低 檢 出 濃 度 為0.94 mg／kg，與上述研究相比，本標準曲線的定量范圍廣、定量限低、準確度和靈敏度高。

圖7 游離棉酚的標準曲線Fig.7 The standar d curve of free gossypol

2.7 方法精密度測定

精密吸取“1.1”項下的棉酚標準儲備液，配制成1.2、4.7、14.6μg／mL 3個不同濃度的棉酚標準溶液，1 d內測定5次，間隔3 h，并連續(xù)測定5 d，計算其日內和日間峰面積平均值及其相對標準偏差（表4）。可知，1.2、4.7、14.6μg／mL 3個不同濃度的標準溶液日內精密度的相對標準偏差分別為2.21%、0.25%、0.43%；日間精密度的相對標準偏差分別為2.84%、0.85%、1.05%，說明棉酚標準溶液在乙腈－0.2%磷酸（體積比為85∶15）溶液中的穩(wěn)定性好，儀器精密度及其穩(wěn)定性良好。

表4 棉酚標準品的日內及日間精密度的測定Table 4 Deter mination of within－day and inter－day precision of gossypol standard

2.8 回收率測定

精確稱取9份已知棉酚含量的棉籽粕樣品3 g，分成3組，每組3個平行，每組分別加入棉酚標準品0.93、1.83、3.84 mg，測定其含量，計算平均回收率及其相對標準偏差（表5）。可知，棉籽粕樣品中棉酚標準品的回收率為94.72%～99.49%，相對標準偏差為1.72%～3.13%，表明樣品的處理方法適合，回收率高，準確性好。

表5 棉酚回收率的測定Table 5 Deter mination of gossypol recovery rates

2.9 穩(wěn)定性測定

精密稱取棉籽粕樣品3份，按照建立的處理方法進行處理，并保存于4℃的冰箱中，在最佳色譜條件下，在配制后的0、3、6、12、18、24、30、36、42、48、54、60 h測定其穩(wěn)定性，記錄其峰面積并計算其相對標準偏差?？芍?，3個樣品在60 h內的峰面積的相對標準偏差分別為9.21%、8.99%、8.40%（表格略），而在36 h內其峰面積相對標準偏差分別為1.51%、3.42%、3.43%（表6），說明棉籽粕樣品中游離棉酚溶解于乙腈－0.2%磷酸（體積比為85∶15）溶液中在4℃條件下36 h內的穩(wěn)定性良好，36 h后不穩(wěn)定，處理的棉籽粕樣品需要在36 h內完成測定，與文獻［16］報道一致。

針對數(shù)字化發(fā)展的趨勢，德國木工機械制造商協(xié)會總經(jīng)理Bernhard Dirr博士表示，德國機械設備制造業(yè)聯(lián)合會和歐洲木材加工機械制造商聯(lián)合會目前正基于OPC UA（開放式平臺通信統(tǒng)一架構），制定相關標準。這將為現(xiàn)代木材加工注入新動力，現(xiàn)在，該領域諸多細分市場已大范圍實現(xiàn)技術成熟。即使是規(guī)模較小的工廠，也能全面掌控智能化發(fā)展趨勢，輕松接入國際網(wǎng)絡，化身具備高度靈活性的小型工廠。

表6 棉籽粕中棉酚穩(wěn)定性的測定Table 6 Deter mination of the stability of gossypol extracted fro m cottonseed meal

2.10 棉籽粕中游離棉酚檢測

稱取3 g棉籽粕樣品5份，根據(jù)前面建立的HPLC法，測定棉籽粕樣品中的游離棉酚含量，計算其平均值及其相對標準偏差（表7）?？芍?，同一棉籽粕5次測定的平均值為60.05 mg／kg，相對標準偏差為0.642%，表明該方法測定準確，重復性好。

在制定還管理制度以后，為了避免員工執(zhí)行的問題，使經(jīng)濟管理達成應有的效果，企業(yè)還要加強內部監(jiān)督，建立完善科學的監(jiān)督機制。這種監(jiān)督機制不要求一成不變，而要求根據(jù)經(jīng)濟管理模式的情況來進行完善與調節(jié)。另外，企業(yè)還要根據(jù)市場營銷的模式發(fā)展情況，采取適當?shù)钠髽I(yè)的經(jīng)濟管理監(jiān)督措施，發(fā)揮監(jiān)督機制的經(jīng)濟管理職能。

表7 棉籽粕中游離棉酚含量的測定Table 7 Deter mination of free gossypol content in cottonseed meal

3 結 論

本試驗優(yōu)化了檢測棉籽粕中游離棉酚含量的HPLC法：以丙酮為提取劑，經(jīng)超聲、離心、抽濾、旋轉蒸發(fā)處理，用乙腈－0.2%磷酸（體積比為85∶15）溶液溶解并以其為流動相，此方法穩(wěn)定性好，精密度、準確度、靈敏度和回收率高。

致謝：感謝上海第二軍醫(yī)大學藥學院董晰教授和日本島津公司分析與檢測中心的周璐穎工程師對本文所提出的寶貴意見。

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