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    有機(jī)污染物的微生物修復(fù)研究進(jìn)展

    2012-03-28 16:47:12王文飛劉銘瑤李德山
    關(guān)鍵詞:加氧酶芳香烴氯乙烯

    王文飛,劉銘瑤,李德山

    (東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,哈爾濱 150030)

    有機(jī)物污染由于其殘留期長(zhǎng)、生物蓄積度高及對(duì)生物體危害性大而備受關(guān)注[1]。目前對(duì)有機(jī)污染物的處理方法主要有填埋法、工程治理法和生物處理法。其中,填埋法由于難以阻止有機(jī)污染物在土壤環(huán)境中的遷移擴(kuò)散以及對(duì)地下水的進(jìn)一步污染,目前已經(jīng)被摒棄;工程治理法由于其投資大、占地多又需特殊設(shè)備,同時(shí)會(huì)產(chǎn)生二級(jí)垃圾,也不是最佳的處理方法。與上兩種方法相比,生物處理法主要利用天然生物(以微生物為主),利用生物體本身作為催化劑來降解環(huán)境中有機(jī)污染物。目前生物處理主要利用從被污染場(chǎng)地中篩選出可利用的菌株對(duì)污染物進(jìn)行處理,由于菌株活力不夠,該方法存在其降解效果不佳,出水COD濃度偏高,難以達(dá)到國(guó)家排放標(biāo)準(zhǔn)等問題,不能完全取代填埋及工程治理法。隨著近幾年分子生物學(xué)及微生物學(xué)的發(fā)展,科研人員通過基因組學(xué)、酶學(xué)等手段對(duì)降解微生物代謝有機(jī)污染物的機(jī)制有了更深的了解,本文總結(jié)了典型的有機(jī)污染物的生物修復(fù)途徑研究進(jìn)展[2-6],為研究人員通過基因工程等技術(shù)進(jìn)行污染物治理菌種的改良提供理論依據(jù)。

    1 微生物修復(fù)

    微生物對(duì)有機(jī)污染物的生物修復(fù)主要通過兩種方式來完成,一種是生長(zhǎng)代謝的方式,另一種是通過微生物的活動(dòng)改變化學(xué)或物理環(huán)境而間接作用于有機(jī)污染物的方式。能夠進(jìn)行生長(zhǎng)代謝生物修復(fù)的微生物本身含降解該有機(jī)物的酶系基因,或本身雖無該酶系基因,但是經(jīng)誘導(dǎo)或環(huán)境存在選擇壓力,基因發(fā)生重組或改變產(chǎn)生了新的降解酶系,能以有機(jī)污染物為碳源和能源物質(zhì)進(jìn)行分解和利用。具有第二種代謝方式的微生物又分為以下3種:①礦化作用:微生物直接以有機(jī)污染物作為生長(zhǎng)基質(zhì),將其完全分解成無機(jī)物;②共代謝作用:共代謝型微生物不能利用有機(jī)污染物作為碳源和能源,須從其它底物中獲取大部分或全部的碳源和能源,共代謝基質(zhì)選擇和代謝酶的誘導(dǎo)是控制目標(biāo)污染物降解的關(guān)鍵因素,高濃度有機(jī)污染物對(duì)共代謝微生物存在明顯的抑制作用;③種間協(xié)同代謝:同一環(huán)境中的幾種微生物聯(lián)合代謝某種有機(jī)污染物。目前對(duì)于微生物生物修復(fù)研究的核心問題是關(guān)鍵酶的誘導(dǎo)及其活性的維持、生長(zhǎng)機(jī)制與目標(biāo)污染物之間的競(jìng)爭(zhēng)抑制、目標(biāo)污染物及其中間降解產(chǎn)物對(duì)微生物毒性作用[7-8]。

    2 有機(jī)污染物的生物修復(fù)途徑

    2.1 芳香烴族化合物的生物修復(fù)途徑

    有機(jī)物、石油、汽油等產(chǎn)品的不完全燃燒和各類工業(yè)活動(dòng)都會(huì)導(dǎo)致芳香烴族化合物特別是多環(huán)芳香烴(PAHs)的產(chǎn)生[9-12],這類物質(zhì)對(duì)自然界的危害極大且利用傳統(tǒng)方法很難消除該類物質(zhì)。近年來的研究結(jié)果顯示,自然界中多種細(xì)菌、真菌和藻類等微生物可以用于PAHs的清除[13]。

    Sims等研究發(fā)現(xiàn),PAHs修復(fù)的第一步反應(yīng)是由雙加氧酶/單加氧酶參與下的氧化芳香環(huán)步驟,此后再經(jīng)過加氫、脫水等作用使C-C鍵斷裂,減少苯環(huán)數(shù),最后將污染物降解為TCA循環(huán)過程中的中間代謝產(chǎn)物[14]。真菌中含有的單加氧酶可加一個(gè)氧原子到苯環(huán)上形成環(huán)氧化物,加入H2O產(chǎn)生反式二醇和酚。細(xì)菌體內(nèi)的雙加氧酶可加兩個(gè)氧原子到苯環(huán)上,氧化為順式二醇,脫氫產(chǎn)生酚,最終將底物降解成三羧酸循環(huán)過程中的中間關(guān)鍵代謝產(chǎn)物,進(jìn)入循環(huán)氧化,近年來的研究結(jié)果顯示這一過程還伴隨著脫氮和硫的還原反應(yīng)[15-16]。

    對(duì)單環(huán)芳香烴苯的降解主要是利用苯雙加氧酶攻擊苯環(huán),形成鄰苯二酚,鄰苯二酚進(jìn)一步通過間位或鄰位雙加氧酶的作用而產(chǎn)生粘康酸半醛或粘康酸,之后代謝產(chǎn)物被進(jìn)一步降解。對(duì)于側(cè)鏈很長(zhǎng)的烷基取代苯,微生物不會(huì)降解苯環(huán);而對(duì)于側(cè)鏈較短的烷基取代苯,一般是使得苯環(huán)的2,3位羥化,形成不穩(wěn)定的鄰苯二酚類物質(zhì),最后開環(huán)降解。

    已有研究表明,克隆編碼甲苯還原酶的基因todC1C2BA,并將重組質(zhì)粒導(dǎo)入P.putida mt-2中,可徹底降解苯、甲苯和二甲苯[17]等單環(huán)芳香烴。吳堅(jiān)陽(yáng)等從農(nóng)藥廠二沉池污泥中篩選分離得到兩株革蘭氏陰性的芳香烴降解菌ZD4-1和ZD4-3,利用紫外光譜掃描和雙加氧酶對(duì)產(chǎn)物的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),菌株ZD4-1利用鄰裂途徑降解苯酚,而ZD4-3則通過間裂途徑降解苯酚,鄰裂途徑的1,2雙加氧酶和間裂途徑的2,3雙加氧酶都是可誘導(dǎo)的雙加氧酶,其活性強(qiáng)烈的依賴于降解底物的出現(xiàn)[18]。劉和從農(nóng)藥廠活性污泥和煤氣廠污水排放口處的土壤中分離到三株降解能力較好的芳香烴降解菌,分別屬于多食鞘氨醇桿菌,睪丸酮叢毛單胞菌和銅綠假單胞菌[19]。其中有關(guān)多食鞘氨醇桿菌對(duì)五氯酚(PCP)的共代謝降解的研究結(jié)果表明,以葡萄糖為生長(zhǎng)底物比以苯酚為生長(zhǎng)底物時(shí)PCP降解效果更好,當(dāng)葡萄糖的量能夠滿足細(xì)菌的生長(zhǎng),提供降解PCP所需的還原性物質(zhì)的量時(shí),則生長(zhǎng)底物不再是PCP降解的限制性因素。

    2.2 環(huán)硝胺類物質(zhì)(RDX、HMX和CL-20)的生物修復(fù)途徑

    環(huán)硝胺類物質(zhì)是軍用火藥,也是一種被廣泛用于化學(xué)工業(yè)和印染工業(yè)中的原料,該物質(zhì)的大量使用對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的污染。目前已發(fā)現(xiàn)多種好氧細(xì)菌、厭氧細(xì)菌和真菌等可以轉(zhuǎn)化RDX、HMX和CL-20,通過微生物的代謝來降低其對(duì)自然界的危害[20]。

    Hawari認(rèn)為硝基還原酶可以催化cL-20首先形成陰離子自由基,使其處于一種易脫硝基的不穩(wěn)定狀態(tài),進(jìn)而發(fā)生開環(huán),生成的中間產(chǎn)物在水溶液中可被分解生成NH4+、N2O、HCOOH和乙二醛[21]。Bhushan等報(bào)道了來源于厭氧菌Clostridium kluyveri的心肌黃酶(EC.1.8.1.4)催化RDX的反應(yīng),發(fā)現(xiàn)RDX在心肌黃酶的作用下,以尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)為氫供體,首先生成陰離子自由基,即為初級(jí)反應(yīng);隨后RDX自由基發(fā)生脫氮反應(yīng),導(dǎo)致開環(huán),最終水解生成N2O、NH4+、HCHO和NO[22]。第二年,Bhushan又利用黃嘌呤氧化酶催化HMX[23],發(fā)現(xiàn)這種酶在厭氧條件下的催化速度優(yōu)于在有氧條件下的催化速度。在還原的過程中,HMX最終被分解產(chǎn)生亞硝酸鹽、亞甲基二硝基胺、甲醛、一氧化二氮和甲酸和銨鹽。

    2.3 烷烴的生物修復(fù)途徑

    對(duì)烷烴類物質(zhì)污染的研究歷史已久。陸健等從原油中分離篩選到一株可高效降解烷烴類物質(zhì)的細(xì)菌(銅綠假單胞菌,XCZ),XCZ以正十八烷為唯一碳源進(jìn)行復(fù)制增值[24]。研究表明,在以濃度為500 mg·L-1正十八烷為唯一碳源的培養(yǎng)基中,持續(xù)培養(yǎng)XCZ 40 h后正十八烷降解率高達(dá)97.5%,同時(shí)XCZ還可有效降解高濃度原油中C_(13)-C_(32)的直鏈烷烴,對(duì) C_(13)-C_(24)烷的降解率大于80%。張璐等從原油污染土壤中分離的一株石油烴降解菌15-3(紅球菌)也可利用正十八烷為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng),且該菌株在低溫(10℃)及高鹽(4%~5%NaCl)等惡劣環(huán)境下也具備良好的降解烷烴能力,對(duì)C_13~C_32的正構(gòu)烷烴、芳香烴及姥鮫烷都有一定的降解能力[25]。

    2.4 多氯聯(lián)苯(PCBs)類物質(zhì)的生物修復(fù)途徑

    PCBs是加工絕緣油、阻燃劑、導(dǎo)熱劑、液壓油、增塑劑等材料的主要原料。由于具有極強(qiáng)的脂溶性,PCBs能夠輕易地進(jìn)入自然界的食物鏈,從而在生物體內(nèi)蓄積進(jìn)而危害人類健康。研究表明以自然界中多種微生物都具備降解PCBs等能力。Seeger、Arsendorf、Abramowicz等研究認(rèn)為,對(duì)于氯取代位點(diǎn)集中在一個(gè)苯環(huán)上的氯代聯(lián)苯,其降解途徑是在2,3雙加氧酶的作用下生成氯代苯甲酸和4-羥基戊酸,生成的4-羥基戊酸可被降解菌株徹底礦化,而另一個(gè)產(chǎn)物氯代苯甲酸需被其他微生物進(jìn)一步降解[26-27]。由于自然界中的PCBs降解菌株的修復(fù)效率比較低,無法滿足治理污染的要求??蒲腥藛T目前已經(jīng)在通過重組DNA的方法獲得高效的工程菌以滿足需要。Brenner等利用2,3-雙加氧酶途徑的關(guān)鍵酶基因和寬宿主范圍的質(zhì)粒構(gòu)建了重組工程菌株,含有上述降解酶基因的大腸桿菌可以直接利用PCBs,而且不需要聯(lián)苯誘導(dǎo),從而大大加快了PCBs的修復(fù)速度[28]。

    2.5 氯乙烯類污染物的生物修復(fù)途徑

    氯乙烯類化合物中常見的是三氯乙烯(TEC),是地下水和土壤中的主要污染物。近年來,大量研究證實(shí)氯化物可通過共代謝好氧途徑降解。Michael等從被四氯乙烯污染的土壤中分離出大量對(duì)四氯乙烯及其潛在的降解產(chǎn)物具有修復(fù)能力的菌株,并在人工條件下進(jìn)行馴化和增殖,通過鼓氣和水流循環(huán)的辦法控制地下微生物的生存環(huán)境,進(jìn)而修復(fù)四氯乙烯污染[29]。檢測(cè)回流水獲得的數(shù)據(jù)顯示,采用改技術(shù)手段后,不到1個(gè)月的時(shí)間內(nèi)水中的四氯乙烯的濃度從470 pg·L-1下降到3.5 pg·L-1,四氯乙烯降解的中間產(chǎn)物三氯乙烯、二氯乙烯和一氯乙烯的濃度也在顯著下降,污染物的總?cè)コ试?0%~99%。

    2.6 硝基化合物的生物修復(fù)途徑

    常見的污染物包括三硝基苯甲硝胺(Tetryl)、梯恩梯(TNT)[30-31]。心肌黃酶是目前公認(rèn)一種可有效修復(fù)由硝基化合物造成的污染的蛋白酶。心肌黃酶是一種黃素蛋白酶,它的功能是制止醌類自由基和醌類自由基引發(fā)的超氧陰離子(O-2)的生成[32]。該蛋白酶不僅對(duì)一些染料既有降解的特性[33],還能夠高效地對(duì)硝基物進(jìn)行催化還原反應(yīng)。心肌黃酶的還原過程是一種單電子傳遞過程[34]。一氧化碳脫氫酶(CODH)在飽和CO條件下,催化TNT轉(zhuǎn)化成2種單羥胺衍生物(2HA46DNT和4HA26DNT),這些衍生物之后轉(zhuǎn)化為24DHANT,后者會(huì)慢慢轉(zhuǎn)化成Bamberger重排產(chǎn)物,從而達(dá)到對(duì)TNT的降解作用。Shah和Spain報(bào)道了一種對(duì)氧敏感的硝基還原酶—鐵氧化還原蛋白NADP氧化還原酶[35],首先轉(zhuǎn)移1個(gè)電子,使三硝基苯甲硝胺生成陰離子自由基,加氫使之脫去硝基,生成亞硝酸鹽,達(dá)到修復(fù)污染的目的。

    3 結(jié)論

    難降解性有機(jī)污染物,如多芳香烴(PAHs)、環(huán)硝胺類物質(zhì)(RDX、HMX、Tetryl和CL-20)、多氯聯(lián)苯(PCBs)、烷烴類化合物、氯乙烯類、硝基化合物(TNT)等物質(zhì)排放量的日益增多,由于傳統(tǒng)方法無法有效去除該類物質(zhì)引起的污染,因此研究更加清潔的方法來解決難降解性有機(jī)污染物迫在眉睫,而微生物的生物修復(fù)方法因其清潔、環(huán)保、不造成二次污染等優(yōu)點(diǎn),成為目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。目前的生物修復(fù)所選用的微生物菌株主要為污染場(chǎng)地篩選出的菌株為主,由于野生菌株處理難降解有機(jī)物時(shí)修復(fù)效率較低,而且分解氧化此類污染水中所含苯酚、氯苯胺及DDT等有機(jī)物的微生物的世代期較長(zhǎng),難以在常規(guī)的生物處理構(gòu)建物中大量存留,因此生物修復(fù)在有機(jī)污染物的處理上還沒有形成規(guī)模。

    除傳統(tǒng)的誘變菌種外,隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)(核酸探針技術(shù)、熒光原位雜交、基因重組及基因芯片技術(shù)等)在環(huán)境微生物中的進(jìn)一步應(yīng)用,對(duì)微生物生物修復(fù)途徑及機(jī)理有了深層次了解。明確化合物的降解途徑和生物降解規(guī)律,在此基礎(chǔ)上構(gòu)建能夠高效降解多種污染物的重組菌株,是開發(fā)新的生物降解技術(shù)、培養(yǎng)和馴化適宜的生物種群和生物酶、以及研究有機(jī)污染物生物降解的必然選擇。

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