殼聚糖生物性能及用于細菌性陰道病的探索與研究

崔惠素，石 巍

天津市醫(yī)療器械技術審評中心，天津市，300191

殼聚糖生物性能及用于細菌性陰道病的探索與研究

【作 者】崔惠素，石 巍

天津市醫(yī)療器械技術審評中心，天津市，300191

目的 通過對殼聚糖抑菌性、生物相容性以及對細菌性陰道病的臨床研究，探討殼聚糖對婦科細菌感染性疾病的療效。方法殼聚糖對白色念珠菌（ATCC 10231）、大腸桿菌（ATCC 25922）、金色葡萄球菌（ATCC 6538）進行抑菌試驗。殼聚糖對雌性白兔進行陰道刺激試驗和致敏試驗。臨床試驗將殼聚糖均勻涂覆在細菌性陰道病患者陰道內(nèi)，每天一次，8天為一個療程，共20例，觀察療效。結果 殼聚糖凝膠對白色念珠菌的抑菌率≥98%，對大腸桿菌的抑菌率≥99%，對金色葡萄球菌的抑菌率≥99%。與陰道粘膜的生物相容性中細胞毒性為1級，無致敏反應，呈極輕微陰道粘膜刺激。對細菌性陰道病的總有效率為90%、愈顯率為75%。

殼聚糖；抑菌；生物相容性

0 引言

甲殼素(chitin)又名甲殼質(zhì)、幾丁質(zhì)，化學名稱為（1，4）-2-乙酰-2-脫氧-β-D-葡萄糖，廣泛存在于海洋中甲殼動物的甲殼中，是自然界唯一一種帶陽離子的氨基多糖，因其從甲殼動物的甲殼中提取，所以具有良好的生物相容性和生物降解性。殼聚糖（Chitosan）的分子式為(C6H11NO4)n，是通過甲殼素脫去乙?；@得的，是一種由氨基葡萄糖和乙?；咸烟峭ㄟ^β-1，4鍵連接而成的聚合糖。殼聚糖與甲殼素一樣具有良好的生物安全性，同時還具有較好的抑菌性能，目前已在醫(yī)藥、食品等領域廣泛應用。在醫(yī)療器械行業(yè)中，殼聚糖產(chǎn)品多用于婦科抗菌膜，手術防粘連膜等。近年來，研究表明分子量的大小和脫乙酰度的高低等指標對殼聚糖抗菌性能影響較大。殼聚糖分子量大小的不同，抑菌機制也可能不盡相同。本論文研究了分子量為100000D-150000D、脫乙酰度≥92.5%、灰分≤1.0%的殼聚糖，對白色念珠菌、大腸桿菌、金色葡萄球菌的抑菌性能，與陰道粘膜生物相容性，及其對細菌性陰道病的療效。

1 抑菌試驗

1.1 材料和方法

1.1.1 材料 殼聚糖溶液的分子量為100 000D-150 000D、脫乙酰度≥92.5%、灰分≤1.0%、無菌(以下簡稱試驗殼漿糖溶液)。

1.1.2 菌株 實驗室用菌株分別為白色念珠菌（ATCC 10231）、大腸桿菌（ATCC 25922）、金色葡萄球菌（ATCC 6538）。

1.1.3 培養(yǎng)基 白色念珠菌使用沙式瓊脂培養(yǎng)基，大腸桿菌和金色葡萄球菌使用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

1.1.4 菌液制備 取菌株第3～14代的沙式瓊脂培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物（18～24 h），用5 ml的0.3 mol/l的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗下菌苔，使菌懸浮均勻后用上述磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋至所需濃度。

1.1.5 試驗方法 將試驗菌24 h斜面培養(yǎng)物用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗下，制成菌懸液(濃度為：100 μl 滴于5 ml樣液內(nèi)，回收菌數(shù)為1×104～9×104cfu/ml)。

被試樣液取5 ml的殼聚糖，對照樣液取經(jīng)滅菌處理后的蒸餾水，各4管。

取菌懸液分別在每份樣液內(nèi)滴加100 μl，均勻混合，開始計時，作用2、5、10、20 min，用無菌加樣器分別將樣液（0.5 ml）加入含5 ml磷酸鹽緩沖液（PBS）的試管內(nèi)，充分混勻，作適當稀釋，然后取其中2～3個稀釋度，分別吸取0.5 ml，置于兩個平皿中，用涼至40℃～45oC的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（金色葡萄球菌和大腸桿菌）或沙式瓊脂培養(yǎng)基（白色念珠菌）15ml作傾注，轉動平皿，使其充分均勻，瓊脂凝固后翻轉平板，35℃±2oC培養(yǎng)48 h（金色葡萄球菌和大腸桿菌）或72 h（白色念珠菌），作活菌菌落計數(shù)。

試驗重復3次，按下式計算抑菌率：

X4=(A-B)/A×100%

式中：X4—抑菌率，%

A—對照樣品平均菌落數(shù)

B—被試樣品平均菌落數(shù)

1.1.6 評價標準 抑菌率≥50%～90%，產(chǎn)品有抑菌作用，抑菌率≥90%，產(chǎn)品有較強抑菌作用。

1.1.7 試驗結果 抑菌試驗表明殼聚糖對白色念珠菌的抑菌率≥98%，對大腸桿菌的抑菌率≥99%，對金色葡萄球菌的抑菌率≥99%。

2 與人體粘膜的生物相容性試驗

2.1 細胞毒性試驗

2.1.1 材料 試驗殼聚糖溶液。

2.1.2 細胞系 L-929細胞系

2.1.3 培養(yǎng)基 RPMI1640基礎培養(yǎng)基

2.1.4 細胞原種培養(yǎng)制備 取出適量的細胞，用機械分散法制成細胞懸浮液。

2.1.5 試驗方法 使用直接接觸法進行試驗。從持續(xù)均勻攪拌的細胞懸浮液中提取等量的懸浮液，加于每只試驗器皿內(nèi)，輕輕轉動器皿，使細胞均勻地分散在每只器皿的表面。選擇含5%CO2的空氣作為緩沖系統(tǒng)，在37oC±2oC下進行培養(yǎng)，直至細胞生長至接近匯合。將殼聚糖輕輕涂覆在每只器皿中央部位，確保其覆蓋細胞層表面的十分之一，然后選擇含5%CO2的空氣作為緩沖系統(tǒng)，在37oC±2oC下進行培養(yǎng)，直至細胞生長至接近匯合。

2.1.6 評價方法 用顯微鏡檢查細胞，評價細胞的一般形態(tài)、空泡形成、脫落、細胞溶解和膜完整性。

2.1.7 評價等級 無細胞毒性、輕度細胞毒性、中度細胞毒性、重度細胞毒性。

2.1.8 試驗結果 通過鏡檢觀察，細胞一般形態(tài)較好，無空泡形成、脫落、細胞溶解等現(xiàn)象，膜完整性良好，故判定為殼聚糖具有輕微細胞毒性。

2.2 陰道刺激試驗

2.2.1 材料 試驗殼聚糖溶液。

2.2.2 對照材料 選用生理鹽水作為對照材料。

2.2.3 試驗動物的選擇 6只體重大于2 kg同一品種的成年健康雌性白兔。3只為實驗組，另外3只為對照組。

2.2.4 試驗方法 將白兔固定，提起白兔尾巴使其陰道口完全暴露，使用容量大于1 ml的無菌注射器，將1 ml的試驗材料和對照材料分別注入試驗組和對照組白兔的陰道內(nèi)，用無菌脫脂紗布輕輕擦去溢出液體，每隔24 h重復上述試驗步驟，連續(xù)試驗10d。

2.2.5 評價方法 無痛處死白兔后，取下陰道組織，從上皮、白細胞浸潤、血管充血、水腫四方面進行組織學評價，并按表1分別對試驗組和對照組打分。

分別計算出試驗組和對照組總平均分，然后用試驗組總評均分減去對照組總平均分得出評價分數(shù)，按表2進行評價。

2.2.6 試驗結果 試驗組白兔上皮存在細胞變性情況，白細胞浸潤少于25，存在極少血管充血和水腫情況；對照組動物上皮組織正常，無白細胞浸潤，存在極少血管充血和水腫情況；陰道刺激試驗得分為3分，表明殼聚糖對陰道存在極輕微刺激。

2.3 致敏試驗

2.3.1 材料 試驗殼聚糖溶液，對照材料選用生理鹽水。

2.3.2 皮內(nèi)注射溶液 A點：弗氏完全佐劑與生理鹽水按50:50的體積比配置成的乳化劑；B點：試驗組選用選定的殼聚糖溶液，對照組選用生理鹽水；C點：試驗組選用選定的殼聚糖溶液、弗氏完全佐劑50:50的體積比共同配置成的穩(wěn)定溶液；對照組選用弗氏完全佐劑與生理鹽水按50:50的體積比配置成的乳化劑。

2.3.3 試驗動物的選擇 選擇10只體重在300 g～500 g的成年、健康白化豚鼠，5只為試驗組，5只為對照組。

2.3.4 試驗方法 分別在圖1所示注射點中注射1 ml相應皮內(nèi)注射溶液。7 d后，試驗組用8 cm2的無菌脫脂紗布浸透所選殼聚糖溶液，覆蓋注射點；對照組用8 cm2的無菌脫脂紗布浸透生理鹽水，覆蓋注射點，封閉包扎固定，48 h后去除。14 d后，試驗組采用浸透皮內(nèi)注射C點濃度的殼聚糖乳化液的無菌脫脂紗布覆蓋注射點并固定，對照組選用浸透皮內(nèi)注射C點濃度的生理鹽水乳化液的無菌脫脂紗布覆蓋注射點并固定，24 h后去除。

觀察情況 分數(shù)1、上皮正常細胞變性或變扁平組織變形局部糜爛廣泛糜爛2、白細胞浸潤無少于2 5 2 6～5 0 5 1～1 0 0大于1 0 0 3、血管充血無極少輕度中度重度伴隨血管破裂4、水腫無極少輕度中度重度0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4

表2 陰道刺激評價表Tab.2 Evaluation list of vaginal irritation experimentation

圖1 試驗注射點示意圖Fig.1 Diagram of injection point of trial

2.3.5 評價方法

去除敷貼48 h后，在自然光條件下觀察豚鼠試驗皮膚變化，如無明顯變化記0分，出現(xiàn)點狀紅斑記1分，融合性紅斑記2分，重度紅斑伴隨水腫記3分。若試驗組各試驗部位記分高于對照組中最嚴重記分，則判定殼聚糖具有致敏性。

2.3.6 試驗結果

通過試驗觀察，未出現(xiàn)試驗組記分高于對照組最嚴重記分情況，表明殼聚糖產(chǎn)品不會產(chǎn)生致敏反應。

3 細菌性陰道病療效觀察

3.1 材料試驗殼聚糖溶液。

3.2 病例選擇

選擇20例年齡在18～50歲確診為細菌性陰道病的女性患者作為受試對象，同時應剔除合并其它外陰、陰道炎患者和過敏體質(zhì)者。

3.3 試驗方法

試驗前按表3對受試者進行評價，確定患病程度?；颊咴陆?jīng)期后3 d，開始使用無菌注射器，每晚在患者陰道均勻內(nèi)注射2.5 ml殼聚糖溶液，持續(xù)8天，停止注射后觀察14 d，試驗期間禁止患者盆浴和性生活。

3.4 評價標準

療效評價記分表，如表3所示。上述三項總平均分為0時，表明患者無細菌性陰道病，總平均分為0～1（包含1）時表明患者呈輕度細菌性陰道病，總平均分為1～2（包含2）時表明患者呈中度細菌性陰道病，總平均分為2～3時表明患者呈重度細菌性陰道病。

3.5 療效評定

痊愈 試驗后總平均分為0。

顯效 試驗后評價結果比試驗前評價結果降低一個檔次以上，如：試驗前評價為重度，試驗后評價為輕度，若試驗后記分為0，則按痊愈統(tǒng)計。

有效 試驗后總平均分相對試驗前總平均分有所減少。

無效 試驗后總平均分相對試驗前總平均分未減少或增加。

3.6 試驗結果

20名受試者中試驗前輕度患者4名，中度患者9名，重度患者7名。其中由輕度轉為痊愈者1名，嚴重度降低等級患者14名，總平均分降低患者3名，未見效果患者2名。愈顯率為75%，有效率為90%。

Research of Bio-performance of Chitosan and Chitosan Being Used for Bacterial Vaginopathy

【W(wǎng)riters】Cui Huisu, Shi Wei

Tianjin Center of Medical Device Evaluation, 300191

Objective Discussing the chitosan’ medical ef fi ciency to treat Gynecology bacteria infectious disease by researching the bacteriostasis, biocompatibility of chitosan and analyzing the chitosan’ medical ef fi ciency to Bacterial vaginosis by clinical examination. Methods The antibiotic experiment of chitosan to Candida albicans (ATCC 10231), Escherichia Coli (ATCC 25922) and Golden staphylococcus (ATCC 6538) has been studied in this paper. The vaginal irritation experimentation of chitosan to female rabbit and the sensitization experimentation of chitosan to guinea pig also have been conducted. To study the curative effect, we also coat a layer of chitosan in 20 patients’ vagina. Result The Antibacterial rate of chitosan to Candida albicans is more than 98% and to Escherichia Coli is more than 99% and to Golden staphylococcus is more than 99%. Cytotoxicity of chitosan to vagina mucosa is grade 1 and sensitization of chitosan to vagina mucosa is none and stimulation of chitosan to vagina mucosa is very slightly. The total ef fi ciency rate to treat Gynecology bacteria infectious disease is 90% and the cure rate is 75%.

chitosan, bacteriostat, biocompatibility

R318.08

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2012.02.005

1671-7104(2012)02-0096-03

2011-12-13

崔惠素，E-mail:cuihuisu@sina.com