不同質(zhì)量濃度氟對(duì)大鼠切牙成釉細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子-β1表達(dá)的影響

張雪莉 張穎 席淑華 程廣巖 郭曉英

（1.中國醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 口腔預(yù)防教研室，沈陽110002；2.中國醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 地球化學(xué)性疾病研究室，沈陽110001）

牙胚發(fā)育是由牙源性上皮與顱神經(jīng)嵴來源的外胚間充質(zhì)之間相互誘導(dǎo)、相互作用的復(fù)雜過程。研究[1-2]表明：轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）在這一過程中起著重要作用。氟斑牙是牙齒在發(fā)育過程中，機(jī)體攝入過量的氟而造成的釉質(zhì)發(fā)育和礦化異常，其病因雖已明確，也有一些治療措施[3]，但發(fā)病機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠氟斑牙模型，觀察不同質(zhì)量濃度的氟對(duì)大鼠切牙成釉細(xì)胞中TGF-β1表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探討氟斑牙形成的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡Wistar大鼠40只（中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體重60～70 g，雌雄各半。

1.1.2 主要試劑及設(shè)備 TGF-β1多克隆抗體、SABC免疫組織化學(xué)試劑盒及DAB顯色劑（武漢博士德生物工程有限公司）；YG-180B1型冷凍包埋機(jī)、YG-280KX型攤片烤片機(jī)（南昌陽光神奇醫(yī)療器械有限公司），Leitz 1512型切片機(jī)（Leitz公司，德國）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠氟斑牙動(dòng)物模型的建立 將40只Wistar大鼠應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組：對(duì)照組（14只）、低劑量氟組（13只）和高劑量氟組（13只）。對(duì)照組大鼠自由飲用蒸餾水，低劑量氟組自由飲用由蒸餾水配制的氟化鈉溶液（F-質(zhì)量濃度60 mg·L-1），高劑量氟組自由飲用由蒸餾水配制的氟化鈉溶液（F-質(zhì)量濃度120 mg·L-1）。飼養(yǎng)室溫度保持在22～25 ℃，各組均給予常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由飲食，喂養(yǎng)10周。

1.2.2 標(biāo)本處理 喂養(yǎng)10周后，乙醚麻醉處死動(dòng)物，完整剝離雙側(cè)下頜骨，修整組織，余留部分為下頜切牙及包繞在切牙周圍的部分頜骨。標(biāo)本用0.01%的PBS溶液沖洗后，置入4%的多聚甲醛溶液中，4 ℃固定30 h；然后置于10%的乙二胺四乙酸二鈉溶液中脫鈣，4 ℃保存，每3 d更換1次脫鈣液。6周后，制作切片。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟定向包埋，沿牙體縱向長軸做近遠(yuǎn)中向連續(xù)切片，片厚6 μm，以多聚賴氨酸處理的載玻片撈片，65 ℃烤片3 h，標(biāo)記備用。

1.2.3 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色 常規(guī)HE染色，光鏡下觀察大鼠切牙發(fā)育中成釉細(xì)胞的形態(tài)。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色 采用常規(guī)免疫組織化學(xué)染色。室溫下石蠟切片脫蠟和水化后，蒸餾水洗3次，每次2 min。3%過氧化氫室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，蒸餾水沖洗3次，每次2 min。采用枸櫞酸緩沖液微波修復(fù)抗原，冷卻至室溫，PBS沖洗2次，每次3 min。滴加正常小牛血清封閉液，室溫孵育20 min，甩去多余液體。滴加一抗，4 ℃過夜。PBS沖洗3次，每次2 min，滴加生物素化二抗，37 ℃溫箱孵育25 min，PBS沖洗3次，每次2 min。滴加SABC試劑，37 ℃溫箱孵育25 min，PBS沖洗4次，每次5 min。DAB鏡下控制顯色，蒸餾水沖洗，蘇木精復(fù)染2 min，1%鹽酸乙醇分化，返藍(lán)，脫水、透明、中性樹膠封片。以PBS代替一抗工作液作為空白對(duì)照，陽性反應(yīng)呈棕黃色顆粒。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用MetaMorph顯微圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行圖像采集，將陽性表達(dá)的強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，對(duì)陽性區(qū)域的染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。每張切片隨機(jī)選擇同一層細(xì)胞不重疊的5個(gè)視野進(jìn)行TGF-β1陽性表達(dá)分析，通過染色強(qiáng)弱對(duì)比進(jìn)行相對(duì)評(píng)價(jià)。檢測染色陽性細(xì)胞的平均光密度（optical density，OD）值。OD值越小，組織中TGF-β1含量越少；OD值越大，組織中含量越多。采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)方法采用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)觀察

3組動(dòng)物的一般狀態(tài)見圖1。

圖1 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠切牙的肉眼觀察Fig 1 Overview of control and experimental groups

由圖1可見：對(duì)照組大鼠切牙發(fā)育良好，牙面為棕黃色，表面光滑，半透明；低劑量氟組切牙的牙面有部分不透光區(qū)，牙面略顯粗糙，釉質(zhì)表面有規(guī)則、細(xì)小的棕白色相間橫紋；高劑量氟組的牙面粗糙明顯，有白堊色改變，棕白相間條紋更加明顯。后兩組均呈現(xiàn)典型氟斑牙癥狀，未見明顯的實(shí)質(zhì)性缺損。

2.2 HE染色結(jié)果

HE染色結(jié)果見圖2。對(duì)照組：成釉細(xì)胞排列均勻，形態(tài)正常，細(xì)胞核遠(yuǎn)離基底膜，釉基質(zhì)釉柱結(jié)構(gòu)清晰可見。低劑量氟組：成釉細(xì)胞呈不規(guī)則排列，原有高柱狀結(jié)構(gòu)變矮，少量細(xì)胞發(fā)生扭曲，成釉細(xì)胞之間可見有空泡性變。高劑量氟組：成釉細(xì)胞排列紊亂，呈灶性堆積，細(xì)胞排列成多層。

圖2 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的組織學(xué)觀察 HE×400Fig 2 Histological observation of control and experimental groups HE×400

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見圖3：TGF-β1在星網(wǎng)狀層、中間層均為陽性表達(dá)，在分泌期和成熟期成釉細(xì)胞均為強(qiáng)陽性表達(dá)，在新形成的釉基質(zhì)中呈陽性表達(dá)。TGF-β1在3組的表達(dá)強(qiáng)度見表1：TGF-β1在低劑量氟組和高劑量氟組成釉細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)度均明顯低于對(duì)照組（P＜0.01），但低劑量氟組和高劑量氟組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 TGF-β1在大鼠切牙成釉細(xì)胞的表達(dá) SABC×400Fig 3 The expression of TGF-β1 in incisor ameloblasts of rats SABC×400

表1 TGF-β1在大鼠切牙成釉細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)度Tab 1 The expression intensity of TGF-β1 in incisor ameloblasts of rats

3 討論

大鼠切牙為無根牙，可終身不斷地產(chǎn)生釉質(zhì)，故可以在同一時(shí)間觀察到不同發(fā)育階段成釉細(xì)胞的形態(tài)，因此大鼠是研究牙齒發(fā)育的理想的動(dòng)物模型。鼠類能耐受的氟的質(zhì)量濃度約為人類的20倍以上。對(duì)大鼠來說，25～30 mg·L-1氟相當(dāng)于人類適宜的飲水氟的質(zhì)量濃度（1 mg·L-1），在此范圍內(nèi)不出現(xiàn)氟斑牙；給予50～60 mg·L-1氟的大鼠飼養(yǎng)30 d多數(shù)會(huì)出現(xiàn)氟斑牙[4]。本文選用F-質(zhì)量濃度60、120 mg·L-1的氟化鈉水溶液研究不同質(zhì)量濃度氟對(duì)大鼠切牙成釉細(xì)胞的影響。

轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）家族是一族具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，在細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生、增殖和分化，細(xì)胞外基質(zhì)的形成，胚胎發(fā)育，骨的形成和重建等方面起著重要作用[5]，同時(shí)也參與了牙胚的發(fā)生、發(fā)展和成熟的過程[6]。TGF-β家族成員通過與Ⅰ型和Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸激酶型受體結(jié)合而發(fā)揮作用。TGF-β與細(xì)胞膜表面的Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸激酶型受體結(jié)合，磷酸化并激活Ⅰ型受體，活化后的Ⅰ型受體作用于下游信號(hào)分子smad2、smad3使其活化，隨后smad2、smad3與smad4結(jié)合形成異源寡聚物由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與其他轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)[7]。

牙胚發(fā)育中，成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化以及牙齒硬組織的形成是一個(gè)典型的由上皮—外胚間充質(zhì)相互誘導(dǎo)、相互作用的過程。TGF-β家族成員作為信號(hào)分子，在這一過程中起重要作用。Bègue-Kirn等[8]研究發(fā)現(xiàn)：TGF-β1能促進(jìn)牙胚成釉細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)，并誘導(dǎo)細(xì)胞分化。Coin等[9]將分離的成釉器在體外進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)，未觀察到前成釉細(xì)胞的極化和功能性成釉細(xì)胞的特性，加入TGF-β1后成釉細(xì)胞才發(fā)生了功能性分化。有研究[10]證實(shí)：在大鼠牙齒發(fā)育的鐘狀期，TGF-β與堿性磷酸酶、纖維結(jié)合素、Ⅰ型及Ⅱ型膠原等與基質(zhì)形成有關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)位置一致，提示TGF-β與基質(zhì)合成有關(guān)。Zhu等[11]用原位雜交法分析TGF-β1 mRNA在鼠牙齒發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)及定位，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)呈時(shí)空依賴性，在蕾狀期、帽狀期牙齒上皮中局部有表達(dá)，在鐘狀期成釉細(xì)胞層和牙乳頭細(xì)胞中大量表達(dá)，隨著成牙本質(zhì)細(xì)胞層和成釉細(xì)胞層細(xì)胞的分化，TGFβ1的表達(dá)增加；因此認(rèn)為TGF-β1在牙生成過程中可能起重要作用，并且是通過旁分泌和自分泌方式起作用的。Fan等[12]也發(fā)現(xiàn)中間層細(xì)胞可以合成TGFβ1，可能是以旁分泌方式調(diào)控成釉細(xì)胞分化的開始。王大勇等[13]通過研究鼠氟斑牙動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)：在鐘狀期，TGF-β1主要分布在中間層細(xì)胞、星網(wǎng)狀層細(xì)胞及成釉細(xì)胞層，牙乳頭及成牙本質(zhì)細(xì)胞也有表達(dá)。由此推測，TGF-β1通過旁分泌和自分泌方式參與了成釉細(xì)胞的終末分化。張瑩等[14]從受體水平上亦證明了TGF-β參與了牙胚發(fā)育的過程。

本實(shí)驗(yàn)觀察到：TGF-β1在大鼠切牙星網(wǎng)狀層細(xì)胞、中間層細(xì)胞均為陽性表達(dá)，表明TGF-β1在牙胚發(fā)育早期參與了牙齒早期形態(tài)的形成與細(xì)胞分化；在分泌期及成熟期成釉細(xì)胞均為強(qiáng)陽性表達(dá)，在新形成的釉基質(zhì)中呈陽性表達(dá)，說明TGF-β1可能與成釉細(xì)胞及成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化及基質(zhì)的形成有密切關(guān)系。這與蘇凌云等[15]觀察到的結(jié)果相一致。程敏等[16]研究顯示：TGF-β1在鐘狀早期，內(nèi)釉細(xì)胞、釉結(jié)、中間層及牙板中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，在外釉細(xì)胞呈陽性表達(dá)；在鐘狀期，前成釉細(xì)胞、成釉細(xì)胞、前牙本質(zhì)細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞中呈強(qiáng)陽性表達(dá)。Tsuchiya等[17]研究發(fā)現(xiàn)：在成熟期成釉器中，TGF-β1的表達(dá)明顯高于早期成釉器，TGF-β1表達(dá)增高使早期成釉器中相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)因子表達(dá)也增加，抑制凋亡的細(xì)胞因子表達(dá)減少，從而認(rèn)為TGF-β1可能在釉質(zhì)發(fā)育成熟期的成釉細(xì)胞凋亡過程中起著重要作用。

氟能抑制成釉細(xì)胞的分化、基質(zhì)合成及分泌，但對(duì)其作用機(jī)制尚缺乏進(jìn)一步研究。TGF-β1在誘導(dǎo)成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化，以及細(xì)胞外基質(zhì)合成等方面具有重要作用。那么，在氟斑牙的形成過程中，過量氟是否通過影響TGF-β1進(jìn)而導(dǎo)致其形成呢? 王穎等[18]通過研究發(fā)現(xiàn)：低質(zhì)量濃度（F-質(zhì)量濃度20 mg·L-1）和中質(zhì)量濃度（F-質(zhì)量濃度50 mg·L-1）的氟顯著抑制TGF-β1的表達(dá)。王大勇等[13]發(fā)現(xiàn)：慢性氟中毒條件下，小鼠切牙成釉器中TGF-β1的表達(dá)受到抑制。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)方法研究氟對(duì)大鼠切牙成釉細(xì)胞TGF-β1表達(dá)的影響，來探討氟斑牙的發(fā)生機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組TGF-β1的表達(dá)明顯低于對(duì)照組。TGF-β1的表達(dá)減弱，說明給氟后TGFβ1的表達(dá)受抑制，提示氟可能通過抑制TGF-β1的表達(dá)而干擾了成釉細(xì)胞的分化和基質(zhì)分泌，造成釉質(zhì)發(fā)育障礙。

[1]Ruch JV,Lesot H,Bègue-Kirn C.Odontoblast differentiation[J].Int J Dev Biol,1995,39（1）：51-68.

[2]Thesleff I,Vaahtokari A,Kettunen P,et al.Epithelial-mesenchymal signaling during tooth development[J].Connect Tissue Res,1995,32（1/2/3/4）：9-15.

[3]陳暉,康媛媛,張英.Beyond冷光美白結(jié)合祛氟劑治療氟斑牙臨床療效觀察[J].中國實(shí)用口腔科雜志,2009,2（1）：39-41.

Chen Hui,Kang Yuanyuan,Zhang Ying.The effect of Beyond cold light whitening combined with fluoride-removing material on bleaching dental fluorosis[J].Chin J Pract Stomatol,2009,2（1）：39-41.

[4]鄧轉(zhuǎn)云,黃瑞哲,郭永利.誘導(dǎo)大鼠下切牙氟斑牙模型所需飲水氟濃度及時(shí)間的篩選[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué),2008,25（4）：12-15.

Deng Zhuanyun,Huang Ruizhe,Guo Yongli.Different doses of sodium fluoride in drinking water induced dental fluorosis oflower incisors in SD rats[J].Laboratory Animal Science,2008,25（4）：12-15.

[5]孫玉鵬,胡蘊(yùn)玉.β轉(zhuǎn)化生長因子研究進(jìn)展[J].中華骨科雜志,1994,14（8）：505-507.

Su Yupeng,Hu Yunyu.Progress of transforming growth factor β[J].Chin J Orthopaedics,1994,14（8）：505-507.

[6]Martín A,Unda FJ,Bègue-Kirn C,et al.Effects of aFGF,bFGF,TGFbeta1 and IGF-Ⅰon odontoblast differentiation in vitro[J].Eur J Oral Sci,1998,106（Suppl 1）：117-121.

[7]Shi Y,Massagué J.Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus[J].Cell,2003,113（6）：685-700.

[8]Bègue-Kirn C,Smith AJ,Ruch JV,et al.Effects of dentin proteins,transforming growth factor beta 1（TGF beta 1）and bone morphogenetic protein 2（BMP2）on the differentiation of odontoblast in vitro[J].Int J Dev Biol,1992,36（4）：491-503.

[9]Coin R,Ha?kel Y,Ruch JV.Effects of apatite,transforming growth factor beta-1,bone morphogenetic protein-2 and interleukin-7 on ameloblast differentiation in vitro[J].Eur J Oral Sci,1999,107（6）：487-495.

[10]Smith AJ,Matthews JB,Hall RC.Transforming growth factor-beta1（TGF-beta1）in dentine matrix.Ligand activation and receptor expression[J].Eur J Oral Sci,1998,106（Suppl 1）：179-184.

[11]Zhu Q,Fan M,Bian Z,et al.In situ hybridization analysis of transforming growth factor-beta 1 RNA expression during mouse tooth development[J].Chin J Dent Res,2000,3（2）：21-25.

[12]Fan MW,Bian Z,Gao YG.Immunohistochemistry and in situ hybridization investigation of transforming growth factor-beta：During odontoblast and ameloblast differentiation[J].Chin J Dent Res,1998,1（2）：17-21.

[13]王大勇,侯鐵舟,王強(qiáng),等.慢性氟中毒對(duì)小鼠切牙胚內(nèi)釉上皮TGF-beta1表達(dá)的影響[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2004,33（11）：963-964,979.

Wang Dayong,Hou Tiezhou,Wang Qiang,et al.Influence of chronic fluorine poisoning on the expression of TGF-beta1 in inner enamel epithelium of mouse incisor[J].Shanxi Medical J,2004,33（11）：963-964,979.

[14]張瑩,張郁,金巖.轉(zhuǎn)化生長因子β受體在牙胚發(fā)育過程中的表達(dá)和意義[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志,1999,9（1）：11-13.

Zhang Ying,Zhang Yu,Jin Yan.The expression and effect of TGF-β receptors in tooth development[J].Chin J Conserv Dent,1999,9（1）：11-13.

[15]蘇凌云,吳補(bǔ)領(lǐng),史俊南.TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3蛋白在人牙胚表達(dá)的免疫組化研究[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志,2000,10（6）：307-309.

Su Lingyun,Wu Buling,Shi Junnan.Immunohistochemical study of TGF-β1,TGF-β2and TGF-β3protein expressions in human tooth germs[J].Chin J Conserv Dent,2000,10（6）：307-309.

[16]程敏,苗雷英,劉玉艷,等.轉(zhuǎn)化生長因子β1和E-鈣黏附分子在人牙胚發(fā)育過程中的表達(dá)及意義[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版,2007,33（6）：1054-1057.

Cheng Min,Miao Leiying,Liu Yuyan,et al.Expressions of TGFβ1 and E-cadherin in human tooth germ development and their significances[J].J Jilin University：Medicine Edition,2007,33（6）：1054-1057.

[17]Tsuchiya M,Sharma R,Tye CE,et al.Transforming growth factorbeta1 expression is up-regulated in maturation-stage enamel organ and may induce ameloblast apoptosis[J].Eur J Oral Sci,2009,117（2）：105-112.

[18]王穎,張安波,陳暉.氟對(duì)體外培養(yǎng)人牙胚TGF-β1表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].口腔醫(yī)學(xué),2009,29（11）：572-575.

Wang Ying,Zhang Anbo,Chen Hui.Experimental study of effects of fluoride on expression of TGF-β1 of human tooth germ cultured in vitro[J].Stomatology,2009,29（11）：572-575.