吡格列酮對(duì)糖尿病大鼠腎臟TIMP-1、TGF-β1和PDGF-β表達(dá)的影響

熊盛池 謝 燕▲ 熊 利

1.四川省涼山彝族自治州第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，四川西昌 615000；2.四川省喜德縣兩河口中心衛(wèi)生院內(nèi)科，四川喜德 615000

吡格列酮為噻唑烷二酮類降糖藥，其作用機(jī)制是高選擇性地激動(dòng)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ），PPAR-γ的活化可調(diào)節(jié)許多控制葡萄糖及脂類代謝的胰島素相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，具有降糖、抗炎、改善脂質(zhì)代謝、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)因子、降低尿蛋白排泄、增加胰島素敏感性等重要作用。本研究以吡格列酮干預(yù)糖尿病（diabetic mellitus，DM）大鼠腎臟基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP1）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β1）和血小板衍生生長(zhǎng)因子β（PDGF-β）的表達(dá)，以觀察其對(duì)糖尿病大鼠腎臟保護(hù)的作用機(jī)制，為臨床對(duì)糖尿病腎病的治療提出良好的參考資料。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 動(dòng)物 6～8周齡、體重180～200 g的健康雄性SD清潔級(jí)大鼠70只，全部購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)SYXK（渝）2004008。

1.1.2 試劑 厄貝沙坦（杭州賽諾菲安萬(wàn)特民生制藥有限公司，J20030113）；吡格列酮（北京太陽(yáng)藥業(yè)有限公司，H20040267） ；PDGF-β兔多克隆抗體，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；TIMP-1試劑盒，購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司；TGF-β1試劑盒，購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制備 按參考文獻(xiàn)[1]稍加修改建立模型。取SD大鼠60只禁食12 h后，按60 mg/kg左下腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ），制造DM大鼠模型。實(shí)驗(yàn)期間給予足夠的飲水，造模4 h后腹腔注射20%的葡萄糖3～5 mL，避免低血糖死亡，72 h后大鼠尾尖取血測(cè)空腹血糖，血糖≥16.0 mmol/L確定為DM成模大鼠。將成模大鼠隨機(jī)抽樣分成4組：吡格列酮組、模型組、吡格列酮+厄貝沙坦組、厄貝沙坦組各14只。同時(shí)取10只正常大鼠作為正常對(duì)照，腹腔注射等劑量無(wú)菌檸檬酸鈉緩沖液，后在尾尖取血測(cè)血糖，血糖均在4.0～8.0 mmol/L。上述方法造模7 d后，吡格列酮組按15 mg/（kg·d）配以3～5 mL蒸餾水灌胃；厄貝沙坦組按50 mg/（kg·d）配以同等量蒸餾水灌胃；吡格列酮+厄貝沙坦組分別給予吡格列酮 15 mg/（kg·d）和厄貝沙坦50 mg/（kg·d）配以同等量蒸餾水灌胃，每日早晨8點(diǎn)～9點(diǎn)灌胃1次，模型組和正常對(duì)照組大鼠每日同一時(shí)間給予等量蒸餾水灌胃。對(duì)血糖≥20.0 mmol/L可能危及生存的大鼠皮下注射諾和靈N 2～3 U以防糖尿病酮癥酸中毒死亡。大鼠自由飲水、進(jìn)食，室溫18～20℃，濕度60% ～70%，上述方法喂養(yǎng)12 周。

1.2.2 取材與固定 所有大鼠在喂養(yǎng)12周后空腹稱重量，以3%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈取血以備行腎功能等生化檢查，后剖腹分離雙側(cè)腎臟，每側(cè)腎臟各取1/2腎組織放入4%多聚甲醛液固定保存24 h后脫水，石蠟包埋，切片，每片厚5 μm，行蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）和免疫組織化學(xué)檢測(cè)。其余腎臟標(biāo)本用液氮冷凍保存，準(zhǔn)備免疫蛋白印跡（Western blotting）等檢測(cè)。

1.3 主要觀察指標(biāo)

（1）一般情況觀察；（2）腎臟病理檢查：處死大鼠時(shí)，肉眼觀察腎臟外觀情況，腎組織行HE染色；（3）腎組織TIMP-1，TGF-β1免疫組化染色（三步法）；（4）Western blotting檢測(cè)糖尿病大鼠腎組織PDGF-β蛋白。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

DM大鼠均出現(xiàn)多尿、煩渴、多飲、體重減輕等糖尿病表現(xiàn)，部分大鼠有視力下降、皮膚潰爛和感染并發(fā)癥。模型組癥狀及并發(fā)癥最明顯，實(shí)驗(yàn)期間有4只死亡；正常組無(wú)死亡大鼠，其余各組癥狀輕微，實(shí)驗(yàn)期間僅有2 只死亡，厄貝沙坦組和吡格列酮組各死亡1只。

2.2 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)的特點(diǎn)

HE染色見(jiàn)模型組大鼠腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚，系膜區(qū)有基底膜基質(zhì)沉積，出現(xiàn)毛細(xì)血管袢折疊和融合，毛細(xì)血管阻塞。吡格列酮組、厄貝沙坦組和吡格列酮+厄貝沙坦組僅有毛細(xì)管基底膜增厚，系膜區(qū)有基底膜基質(zhì)沉積，且明顯輕于模型組。正常對(duì)照組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯異常。見(jiàn)圖1。

2.3 各組大鼠TIMP-1的表達(dá)

TIMP-1陽(yáng)性染色主要位于腎小球毛細(xì)血管基底膜、系膜區(qū)、腎小管基底膜及毛細(xì)血管袢處。正常對(duì)照組大鼠腎小球毛細(xì)血管基底膜、系膜區(qū)、腎小管基底膜上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管袢處僅有微弱表達(dá)，見(jiàn)圖2。定量分析顯示，模型組TIMP-1上述部位表達(dá)顯著多于正常對(duì)照組，吡格列酮組、厄貝沙坦組和吡格列酮+厄貝沙坦組TIMP-1表達(dá)顯著少于模型組，吡格列酮組+厄貝沙坦組表達(dá)減少較吡格列酮組和厄貝沙坦組更為明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），不過(guò)上述部位表達(dá)均多于正常對(duì)照組；吡格列酮組與厄貝沙坦組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05） 。

圖1 A-E 各組大鼠腎臟HE染色（×200）

圖2 A-E 各組大鼠腎臟免疫組化TIMP-1的表達(dá)（×200）

2.4 各組大鼠TGF-β1表達(dá)

糖尿病大鼠與正常對(duì)照組大鼠比較，前者腎小球臟層上皮細(xì)胞、毛細(xì)血管基底膜及系膜區(qū)腎小球上皮細(xì)胞、腎小管基底膜及及毛細(xì)血管袢TGF-β1均有明顯表達(dá)，后者TGF-β1主要在腎小球臟層上皮細(xì)胞、毛細(xì)血管基底膜及系膜區(qū)有微弱表達(dá)。見(jiàn)圖3。定量分析顯示，模型組TGF-β1表達(dá)顯著多于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；厄貝沙坦組、吡格列酮組和吡格列酮+厄貝沙坦組TGF-β1表達(dá)顯著少于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；吡格列酮+厄貝沙坦組TGF-β1表達(dá)顯著少于吡格列酮組和厄貝沙坦，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），不過(guò)上述部位表達(dá)仍然多于正常對(duì)照組；厄貝沙坦組與吡格列酮組TGF-β1表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1 。

圖3 A-E 各組大鼠腎臟免疫組化TGF-β1的表達(dá)（×200）

表1 12周后各組大鼠腎臟組織TIMP-1和TGF-β1的表達(dá)（±s）

表1 12周后各組大鼠腎臟組織TIMP-1和TGF-β1的表達(dá)（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與厄貝沙坦組比較，#P＜0.01；與吡格列酮+厄貝沙坦組比較，&P＜0.05

組別 n TIMP-1 TGF-β1正常對(duì)照組 10 0.072±0.016 0.057±0.016模型組 11 0.201±0.013* 0.195±0.016*吡格列酮組 12 0.148±0.014*△& 0.131±0.020*△&厄貝沙坦組 12 0.142±0.022*△ 0.129±0.021*△吡格列酮+厄貝沙坦組 12 0.112±0.015*△# 0.102±0.015 *△#

2.5 各組大鼠PDGF-β表達(dá)

Western blotting檢測(cè)技術(shù)顯示，模型組大鼠腎組織PDGF-β表達(dá)顯著多于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；正常對(duì)照組腎組織PDGF-β僅有微弱表達(dá)，厄貝沙坦組、吡格列酮組、吡格列酮+厄貝沙坦組PDGF-β表達(dá)顯著少于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；吡格列酮+厄貝沙坦組PDGF-β表達(dá)少于厄貝沙坦組、吡格列酮組，而多于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；吡格列酮組與厄貝沙坦組PDGF-β表達(dá)比較，差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖4、表2。

圖4 各組大鼠腎臟Western blotting PDGF-β的表達(dá)（依次為厄貝沙坦組，糖尿病模型組，吡格列酮組+厄貝沙坦組，吡格列酮組，正常對(duì)照組）

表2 12周后各組大鼠腎臟組織PDGF-β的表達(dá)（±s）

表2 12周后各組大鼠腎臟組織PDGF-β的表達(dá)（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與厄貝沙坦組比較，#P＜0.01；與吡格列酮組比較，&P＜0.05

組別 n 腎PDGF-β正常對(duì)照組 10 63 542±1 245模型組 10 136 453±1 756*吡格列酮組 10 96 428±1 603*△厄貝沙坦組 10 97 439±1 667*△吡格列酮+厄貝沙坦組 10 84 539±1 167*△&#

3 討論

TGF-β1是促纖維化最重要的因子之一，通過(guò)刺激細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生[2]，抑制蛋白酶和膠原酶，減少基質(zhì)的降解，使細(xì)胞外基質(zhì)在腎臟大量沉積，進(jìn)一步發(fā)展為腎組織纖維化。腎纖維化是細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積所致，但膠原的降解減少也是重要原因。細(xì)胞外基質(zhì)由基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及其抑制因子TIMPs調(diào)節(jié)，前者的作用是降解膠原，而后者的作用恰恰是對(duì)抗MMPs，導(dǎo)致膠原的降解減少。所以增加MMPs或減少TIMP-1在腎組織的表達(dá)，均可使細(xì)胞外基質(zhì)減少。因此TIMP-1對(duì)腎纖維化的形成有不容忽視的重要地位[3]。PDGF是一種潛在的促有絲分裂的細(xì)胞因子，主要分布于增生的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和增生的腎小球細(xì)胞。一旦受到病理刺激，特別是糖尿病的長(zhǎng)期刺激，PDGF就在上述部位過(guò)度表達(dá)，促進(jìn)系膜細(xì)胞增生和細(xì)胞基質(zhì)沉積，進(jìn)而引起腎纖維化，最終糖尿病腎病一步一步形成，以致終末期腎病，腎衰竭。實(shí)驗(yàn)表明糖尿病大鼠腎小球PDGF-β和PDGF-β受體表達(dá)均增加[4]，PDGF-β鏈m RNA在糖尿病腎病小鼠腎組織中表達(dá)明顯上調(diào)[5]。本研究中糖尿病大鼠腎組織PDGF-β表達(dá)增多，進(jìn)一步肯定了這一研究。

近年來(lái)，隨著羅格列酮爭(zhēng)議不斷，甚至于2010年9月23日已被FDA叫停，為了避免醫(yī)患糾紛，大部分醫(yī)務(wù)人員已經(jīng)明顯的減少了對(duì)該藥的使用。吡格列酮為噻唑烷二酮類降糖藥，藥效肯定，價(jià)格低廉，在臨床上廣泛運(yùn)用，不失為羅格列酮的絕佳替代品，最近的研究表明低劑量的吡格列酮長(zhǎng)期治療，可以顯著改善糖尿病腎病患者的腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化，延緩腎功能的惡化[6]，達(dá)到治療的目的。而這些作用均與吡格列酮的抗氧化、抗炎、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)因子、降低尿蛋白排泄率作用密切相關(guān)。吡格列酮已經(jīng)被證實(shí)可以降低甘油三酯、增加高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）而調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，從機(jī)制上有可能延緩動(dòng)脈粥樣硬化的形成[7]。大量研究表明吡格列酮可以減少TGF-β1在腎小球和腎小管的表達(dá)[8]。同時(shí)吡格列酮可以減少TIMP-l在糖尿病大鼠心肌組織的表達(dá)，通過(guò)抑制心肌纖維化的形成來(lái)實(shí)現(xiàn)[9]，就機(jī)制來(lái)說(shuō)均是對(duì)組織纖維化的抑制，那么對(duì)腎組織纖維化的影響是不是一樣的呢？本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步肯定了這一論點(diǎn)。研究表明吡格列酮能減少或抑制PDGF-β在DM大鼠的腎小球和腎小管的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)MMP-2的表達(dá)，抑制腎成纖維細(xì)胞IV型膠原的合成[10]，改善高糖狀態(tài)下的腎小球和腎小管間質(zhì)的纖維化，調(diào)節(jié)腎組織細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解，延緩糖尿病腎損害的進(jìn)展，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

[1] 李偉，張紅，殷松樓，等.不同劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)SD大鼠糖尿病腎病模型的研究[J].徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，26（1）：52-55.

[2] Nam JS，Cho MH，Lee GT，et al.The activation of NF-kappa B and AP-1 in peripheral blood mononuclear cells isolated from patients with Diabetic nephropathy[J].Diabetes Research Clinical Practice，2008，81（1）：25-32.

[3] Suzuki D，Miyazaki M，Jinde K，et al.In situ hybridization studies of matrix metalloproteinase-3, tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and type IV collagen in diabetic nephropathy[J].Kidney International，1997，52（1）：111-119.

[4] Nakagawa H，Sasahara M，Haneda M，et al.Immunohistochemical characterization of glomerular PDGF-B chain and PDGF-B receptor expression in diabetic rats[J].Diabetes Research and Clinical Practice，2000，48（2）：87-98.

[5] Uehara G，Suzuki D，Toyoda M，et a1.Glomerular expression of plateletderived growth factor (PDGF)-A, -B chain and PDGF receptor-alpha，-beta in human diabetic nephropathy[J].Clinical and Experimental Nephrology，2004，8（1）：36-42.

[6] Toblli JE，F(xiàn)errini MG，Cao G，et al.Antifibrotic effects of pioglitazone on the kidney in a rat model of type 2 diabetes mellitus[J].Nephrology Dialysis Transplantation，2009，24（8）：2384–2391.

[7] 趙紅梅，吳鏗.吡格列酮在抗動(dòng)脈粥樣硬化中的作用[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2010，5（2）：555-557.

[8] 李紅，鄭芬萍，阮昱，等.吡格列酮對(duì)糖尿病大鼠腎皮質(zhì)TGF-β1基因表達(dá)的抑制作用[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志，2003，19（3）：238-239.

[9] 王綿，張力輝，鄧永貴，等.2型糖尿病大鼠心肌組織MMP-2、MMP-9、TIMP-1的表達(dá)與膠原代謝的關(guān)系[J].中國(guó)糖尿病雜志，2006，14（2）：133-136.

[10] 阮昱，李紅，鄭紅平，等.吡格列酮對(duì)糖尿病大鼠腎臟轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1及Ⅳ型膠原表達(dá)的作用[J].中華糖尿病雜志，2004，12（50）：65-68.