Ets-1和MMP-9與亞臨床絨毛膜羊膜炎的關(guān)系探討*

陳春瑩 李 麗 劉小樂(lè) 陳曼詩(shī) 黃海玉

廣東省深圳市第四人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 深圳 518033

胎膜早破(premat ure rupture of membrane, PROM)是產(chǎn)科常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，近年來(lái)其發(fā)病率有上升趨勢(shì)，其發(fā)生機(jī)制仍不十分清楚，認(rèn)為感染等多種因素導(dǎo)致胎膜細(xì)胞外基質(zhì)的降解增多，從而胎膜發(fā)生破裂，胎膜破裂后，致病菌沿生殖道上行進(jìn)入羊膜腔，使感染的機(jī)會(huì)增多，但當(dāng)胎膜早破并發(fā)絨毛膜羊膜炎時(shí)大多無(wú)臨床癥狀，表現(xiàn)為亞臨床感染，威脅母兒安全。本研究采用免疫組化方法檢測(cè)Ets-1和MMP-9在胎膜中的表達(dá)，了解其在胎膜早破發(fā)生、發(fā)展中的作用及其與亞臨床絨毛膜羊膜炎的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取深圳市福田區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科2010年1月至2010年10月的胎膜早破(PROM)患者50例,年齡(28.1±3.4)歲,孕次1.33±0.66；足月無(wú)產(chǎn)兆擇期剖宮產(chǎn)患者45 例(其手術(shù)指征分別為:臀位10例；巨大兒5例；高齡初產(chǎn)5例；社會(huì)因素25例),年齡(28.5±4.1)歲,孕次1.47±0.75,作為對(duì)照組。兩組均為初產(chǎn)婦,單胎,無(wú)內(nèi)外科合并癥及病理性產(chǎn)科并發(fā)癥,近期無(wú)外傷和性交等明顯誘因,兩組患者年齡及孕次均符合正態(tài)分布,且二者比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。所有病例經(jīng)病理檢測(cè)又分為絨毛膜羊膜炎組和非絨毛膜羊膜炎組。

1.2 絨毛膜羊膜炎的診斷標(biāo)準(zhǔn) 孕婦體溫≥38℃或連續(xù)2次間隔1h以上體溫>37.5℃而排除其他感染存在及至少有下列4項(xiàng)中的1 項(xiàng):(1)孕婦心率≥100次/min或原因不明的胎心率≥160次/mim；(2)子宮有壓痛；(3)白細(xì)胞計(jì)數(shù)>15×109L-1；(4)排出物有臭味或呈膿性。如果孕婦體溫正常,則必須同時(shí)具備上述四項(xiàng),診斷方成立。僅出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)異常,則診斷為亞臨床型絨毛膜羊膜炎[1]。絨毛膜羊膜炎的病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]:在絨毛膜及羊膜組織中,中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)每高倍視野5～10個(gè)為輕度；11～30個(gè)為中度；大于30個(gè)為重度。

1.3 胎膜標(biāo)本采集及處理 所有產(chǎn)婦在胎盤(pán)胎膜娩出后立即剪取距胎膜破口處>2cm的全層胎膜組織，2cm×2cm大小，生理鹽水沖凈血跡和羊水，10%福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包理，均作4μ m厚連續(xù)切片2張，一張行HE染色診斷行病理檢查，了解是否存在絨毛膜羊膜炎，采用雙盲法由專(zhuān)人看片。另一張采用免疫組織化學(xué)技術(shù)測(cè)定Ets-1和MMP-9表達(dá)水平。

1.4 主要試劑 Ets1 鼠抗人多克隆抗體(克隆號(hào)sc2350)為Santa－Cruz公司產(chǎn)品, 兔抗人MMP-9多克隆抗體、通用型S-P免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.5 方法 采用免疫組化中敏感性高的親和組織化學(xué)技術(shù)：酶標(biāo)鏈親和素－生物素技術(shù)（S-P）法。以PBS代替第一抗體作為陰性對(duì)照，以胎膜各層部分細(xì)胞胞漿和（或）胞核出現(xiàn)棕色顆粒狀物質(zhì)視為陽(yáng)性染色。

1.6 結(jié)果判定 以染色強(qiáng)度與陽(yáng)性染色細(xì)胞百分率的乘積作為半定量標(biāo)準(zhǔn)。高倍鏡下每張切片選擇10個(gè)有代表性的視野,每個(gè)視野記數(shù)100個(gè)細(xì)胞。①染色強(qiáng)度計(jì)分: 0分為無(wú)色,1分為淡黃色,2分為棕黃色,3分為黃褐色；②按陽(yáng)性染色細(xì)胞百分率計(jì)分。0分為陰性,1分為陽(yáng)性細(xì)胞0%～25%,2分為25%～50%，3 分為51%～75%,4分為>75%。最后將陽(yáng)性率評(píng)分與強(qiáng)度評(píng)分相乘所得之積計(jì)為該組織的免疫組化最終評(píng)分。綜合評(píng)分為1～2分者為弱陽(yáng)“+”,3～4分者為陽(yáng)性“+ +”,5～7分者為強(qiáng)陽(yáng)性“+ + +”。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié) 果

2.1 絨毛膜羊膜炎的病理學(xué)診斷情況 見(jiàn)表1 ,研究組臨床未診斷出絨毛膜羊膜炎,診斷亞臨床型絨毛膜羊膜炎34例(34/50),后經(jīng)病理學(xué)證實(shí)均為絨毛膜羊膜炎共34例,其中輕度有5例(5/50),中度有10 例(10/50),重度有19例(19/50)。對(duì)照組胎膜病理學(xué)檢測(cè)出絨毛膜羊膜炎共10例,其中輕度4例(4/ 45),中度4例(4/45),重度有2例(2/45)。

2.2 Ets-1和MMP-9在各組中的表達(dá) 見(jiàn)表2,對(duì)所收集的組織樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,發(fā)現(xiàn)Ets-1和MMP-9在各組中均有不同程度的表達(dá),如表2所示,但研究組的表達(dá)明顯高于對(duì)照組,兩者間差異有顯著意義(P< 0.05),在病理學(xué)診斷絨毛膜羊膜炎的病例中炎癥越重的病例Ets-1和MMP-9的表達(dá)越明顯。

3 討 論

胎膜破裂發(fā)生于產(chǎn)程正式開(kāi)始前稱(chēng)為胎膜早破(premat ure rupture of membrane, PROM),胎膜早破是產(chǎn)科常見(jiàn)的并發(fā)癥之一,日益受到關(guān)注,其發(fā)生機(jī)制的研究仍不十分清楚,在所有發(fā)生胎膜早破的因素中,感染是其最重要的原因,且與胎膜早破互為因果。胎膜早破的發(fā)生并不等于感染的發(fā)生,但提示機(jī)體有發(fā)生感染的極大可能性,胎膜早破持續(xù)時(shí)間越久,母嬰接觸病原體機(jī)會(huì)越多,感染機(jī)率越大。羊膜腔感染的征象常出現(xiàn)在感染的晚期,組織學(xué)上有絨毛膜羊膜炎證據(jù)的患者中僅有25%出現(xiàn)臨床征象[3]。本研究觀察除34 例患者表現(xiàn)亞臨床絨毛膜羊膜炎外均未出現(xiàn)臨床感染,但其病理提示有68%存在絨毛膜羊膜炎的組織學(xué)證據(jù),故胎膜早破仍是羊膜腔感染的重要因素。

Ets-1是Ets轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族中最基本的成員之一[4],是分子量為54ku的核內(nèi)蛋白,同時(shí)又是編碼降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix, ECM)的蛋白酶(諸如MMP1、MMP3、MMP9等)等許多基因的必需轉(zhuǎn)錄因子。MMP-9是明膠酶中的一種，除有MMPs的原型結(jié)構(gòu)外，MMP-9的催化區(qū)還包括3個(gè)重復(fù)的型纖維連接蛋白結(jié)構(gòu)域，這個(gè)結(jié)構(gòu)域與明膠或彈性蛋白有高度的親和力。MMP-9包含一個(gè)V型的膠原蛋白結(jié)構(gòu)域,這個(gè)結(jié)構(gòu)域有高度的糖基化作用，它影響底物的特異性以及有抗衰變的作用。目前, 已證實(shí)MMPs啟動(dòng)子區(qū)域的PEA23位點(diǎn)可與Ets-1結(jié)合,是一個(gè)功能轉(zhuǎn)錄元件[5],而MMP9 基因啟動(dòng)子序列上有4個(gè)Ets-1結(jié)合元件,故Ets-1可上調(diào)MMP9的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)在胎膜早破 病例中,與正常對(duì)照組相比,其胎膜的Ets-1和MMP-9 蛋白的表達(dá)量明顯增加.

表1 兩組病理檢查結(jié)果

表2 Ets-1和MMP-9 在各組中的表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,胎膜早破組絨毛膜羊膜炎的發(fā)生率為68%,而對(duì)照組為22.22%,兩組比較差異有顯著意義(P<0.01),說(shuō)明胎膜早破與感染互為因果[6]。在各組胎膜中均能檢測(cè)到Ets-1和MMP-9的存在,但在胎膜早破中表達(dá)水平增高,而且在胎膜早破合并感染時(shí), Ets-1和MMP-9在胎膜組織中的表達(dá)水平更明顯增加,表達(dá)程度與感染程度相關(guān),感染越重表達(dá)越明顯,其表達(dá)量高于胎膜早破非感染組和足月組。在胎膜早破患者中,發(fā)現(xiàn)其滋養(yǎng)層細(xì)胞出現(xiàn)排列紊亂,膠原斷裂及部分滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡,這種形態(tài)學(xué)改變可能與維持胎膜緊張度的ECM降解加速有關(guān)。在胎膜中ECM 降解的調(diào)節(jié)和動(dòng)態(tài)變化是由MMPs所控制,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多MMPs(包括MMP1,MMP2,MMP9)在胎膜早破的羊水和胎膜中被上調(diào),且MMPs在基因轉(zhuǎn)錄、活化水平上被調(diào)節(jié)。在這些基因中和轉(zhuǎn)錄因子Ets-1有關(guān)的是編碼某些蛋白酶的基因,諸如MMP1、MMP2、MMP3和MMP9[7]由此我們可以看出,胎膜滋養(yǎng)層中Ets-1蛋白表達(dá)量增加可引起MMPs基因產(chǎn)物的增加,這就導(dǎo)致此區(qū)域ECM的降解加速,打破了能維持胎膜張力的細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡。ECM的降解導(dǎo)致胎膜結(jié)構(gòu)的減弱和破裂從而引起胎膜早破。基因轉(zhuǎn)錄增加的重要原因之一是轉(zhuǎn)錄因子蛋白增加或轉(zhuǎn)錄活性增加。這進(jìn)一步說(shuō)明,轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Ets-1蛋白在胎膜早破絨毛膜滋養(yǎng)層中高表達(dá),其通過(guò)對(duì)靶基因MMP1,MMP3,MMP9,u2PA和整合素β3等的調(diào)控,導(dǎo)致其產(chǎn)物增加,從而使ECM降解加速和重塑。

本研究表明, Ets-1和MMP-9與胎膜早破及絨毛膜羊膜炎的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系,目前對(duì)Ets-1和MMP-9如何調(diào)節(jié)胎膜早破的發(fā)動(dòng)尚不清楚,隨著對(duì)細(xì)胞因子生物學(xué)的逐步深入,這個(gè)秘密終會(huì)揭開(kāi),而深入了解胎膜早破的發(fā)生機(jī)制必將有助于人們發(fā)現(xiàn)治療新方法,有助于預(yù)測(cè)胎膜早破及絨毛膜羊膜炎發(fā)生,對(duì)降低母嬰并發(fā)癥和預(yù)防新生兒遠(yuǎn)期并發(fā)癥有一定價(jià)值。

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