食品微生物檢測技術(shù)研究進(jìn)展

王秀芹，張 敏，顏 萍

(1.朝陽師范高等?？茖W(xué)校，遼寧 朝陽 122000;2.北京匯源飲料食品集團(tuán)有限公司檢測中心，北京 101305;3.山東省膠州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，山東膠州 266300)

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷提高，人民生活水平的日益增長，食品的安全問題越來越成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，食品中暴露出的問題也越來越多，人們對于食品的安全則有了更高的要求。國家對于食品衛(wèi)生的檢測力度也逐漸增強(qiáng)，食品微生物檢驗(yàn)是評價食品衛(wèi)生質(zhì)量、保證食品安全、預(yù)防和控制食源性疾病的重要手段之一。因此，食品中關(guān)于微生物檢測方法和技術(shù)的探討也顯得尤為重要。

1 分子生物學(xué)方法

1.1 PCR 檢測

PCR(Polymerase Chain Reaction)聚合酶鏈反應(yīng)，是由Kary Mullis等人首創(chuàng)的一項體外快速擴(kuò)增DNA的方法，它可使極微量的某一特定序列的DNA片斷在數(shù)小時內(nèi)特異性擴(kuò)增至百萬倍以上［1］。PCR 反應(yīng)是將模板 DNA、引物、Taq酶、dNTPs、鎂離子、緩沖液、雙蒸水等混合物裝在PCR微型管中，在可編程調(diào)控的PCR儀上完成。

PCR技術(shù)具有簡易、快速、靈敏和高特異性的優(yōu)點(diǎn)，可以擴(kuò)增待檢微生物目的DNA很快判斷某種微生物是否存在。PCR技術(shù)還可以檢測那些人工無法培養(yǎng)或難以培養(yǎng)的微生物，從而大大增加診斷檢查內(nèi)容和診斷能力。目前，已經(jīng)有了自動化PCR檢測試劑盒儀器，使用比較方便，但仍然需要增加一些專用的設(shè)備。PCR技術(shù)可以對特定的致病菌進(jìn)行檢測，已經(jīng)成功地對沙門氏菌［2］、大腸埃希菌 O157∶H7［3］、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌［4］等致病菌進(jìn)行了有效測定。PCR技術(shù)也存在著假陽性問題、假陰性問題以及定量困難的問題，所以還不能成為一種常規(guī)檢測方法。

1.2 核酸探針技術(shù)

核酸探針技術(shù)是用同位素或其他的標(biāo)記方法對已知核苷酸序列DNA片段進(jìn)行標(biāo)記，將其加入到已變異的DNA樣品。這樣在一定的條件下就能和這種樣品的同源序列的DNA區(qū)段形成雜交雙聯(lián)，達(dá)到鑒定DNA的目的。核酸探針檢測技術(shù)具有特異性、敏感性的優(yōu)點(diǎn)，但也存在一些問題，如一種菌需要制備一種探針;對樣品進(jìn)行一段時間的培養(yǎng)才能達(dá)到檢測量;對毒素污染的不含產(chǎn)毒菌的食品無法檢測［5］。

2 代謝學(xué)技術(shù)

2.1 電阻抗技術(shù)

電阻抗技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項生物學(xué)技術(shù)，已經(jīng)開始應(yīng)用于微生物的檢測。它是指細(xì)菌在培養(yǎng)基內(nèi)生長繁殖的過程中，將會使培養(yǎng)基中的大部分電惰性物質(zhì)，代謝為具有電活性的小分子物質(zhì)，其能增加培養(yǎng)基的導(dǎo)電性，使阻抗發(fā)生變化，通過檢測培養(yǎng)基的電阻抗變化來判定細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長繁殖特性，即可檢測出相應(yīng)的細(xì)菌。該方法已用于食品中細(xì)菌總數(shù)、大腸埃希菌、沙門氏菌等［6］微生物的檢測，且具有高敏感性、特異性、快速反應(yīng)性和高度重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)。

2.2 微熱量計技術(shù)

微熱量計技術(shù)是通過細(xì)菌生長時熱量的變化對細(xì)菌進(jìn)行檢出和鑒別。微生物在生長過程中產(chǎn)生熱量，用微熱量計測量產(chǎn)熱量等數(shù)據(jù)，存儲于計算機(jī)中，經(jīng)過適當(dāng)信號上的數(shù)字模擬界面，在記錄器上繪制成以產(chǎn)熱量對比時間組成的熱曲線圖，與已知細(xì)菌熱曲線圖比較，即可對細(xì)菌進(jìn)行鑒別。目前，應(yīng)用該技術(shù)研究細(xì)菌的抑制作用［7］。

2.3 放射測量技術(shù)

放射測量技術(shù)(RM)是物理與化學(xué)診斷一體的新型檢測技術(shù)，主要用于培養(yǎng)基中微生物的檢驗(yàn)。根據(jù)細(xì)菌在生長繁殖過程中代謝碳水化合物產(chǎn)生CO2的原理，把微量的放射性14C標(biāo)記引入碳水化合物或鹽類等底物分子中進(jìn)行檢測的技術(shù)［8］。細(xì)菌生長時，這些底物被利用并釋放出含放射性的14CO2，然后自動化放射測定儀Bactec測量14CO2的含量，來判斷細(xì)菌的數(shù)量。本方法具有快速、準(zhǔn)確度高和自動化等優(yōu)點(diǎn)。放射測量技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于大腸埃希菌的定量檢測。

3 免疫分析檢測

3.1 免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence Technique)就是用熒光素標(biāo)記的抗體檢測抗原或抗體的免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)。所用的熒光素標(biāo)記抗體通稱為熒光抗體。實(shí)際應(yīng)用上主要有直接法和間接法。直接熒光抗體檢測法是在檢樣上直接滴加已知特異性熒光標(biāo)記的抗血清，經(jīng)洗滌后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。間接法是在檢樣上滴加已知細(xì)菌特異性抗血清，待作用后經(jīng)洗滌，再加入熒光標(biāo)記的抗體后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。可用來對沙門氏菌、李斯特菌、葡萄球菌毒素、E.coli O157和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌等進(jìn)行快速檢測。王軍等［9］建立了養(yǎng)殖大黃魚病原溶藻弧菌的間接熒光抗體免疫快速檢測技術(shù)。該技術(shù)的主要特點(diǎn)是特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。但是還存在一定的不足，如非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序比較復(fù)雜。

3.2 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附技術(shù) ELISA技術(shù)(enzyme，linked fluorescent immunoassay)，全稱熒光酶標(biāo)免疫分析，最早出現(xiàn)于19世紀(jì)70年代，它是在酶聯(lián)免疫吸附分析的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種快速、先進(jìn)的現(xiàn)代食品微生物分析檢測方法，最近幾年出現(xiàn)了更靈敏的顯色劑和底物，提高了ELISA的有效性。ELISA技術(shù)是將抗原或抗體吸附于固相載體，在載體上進(jìn)行免疫酶染色，底物顯色后，通過定性或定量分析有色產(chǎn)物量即可確定樣品中待測物質(zhì)含量。它結(jié)合了免疫熒光法和放射免疫測定法2種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有可定量、反應(yīng)靈敏準(zhǔn)確、標(biāo)記物穩(wěn)定、適用范圍寬、結(jié)果判斷客觀、簡便完全、檢測速度快以及費(fèi)用低等特點(diǎn)，可同時進(jìn)行上千份樣品的分析。近年來，ELISA技術(shù)已經(jīng)逐步應(yīng)用與食品中大腸埃希菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等方面的檢測分析［10］。

酶聯(lián)熒光免疫分析技術(shù)是將酶系統(tǒng)與熒光免疫分析結(jié)合起來，在普通酶免疫分析的基礎(chǔ)上用理想的熒光底物代替生色底物，可提高分析的靈敏度和增寬測量范圍，減少試劑的用量。酶放大技術(shù)、同相分離及熒光檢測三者的聯(lián)合將成為熒光免疫分析中最靈敏的方法。

4 分析化學(xué)技術(shù)

分析化學(xué)技術(shù)的不斷更新，使儀器分析手段和方法在微生物檢測方面取得了一定的地位。如高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LCMS/MS)等。這些方法不同于依賴微生物生物學(xué)特征的檢測方法，而是通過分析微生物的化學(xué)組成(生物標(biāo)志物)來區(qū)分和鑒定微生物，開辟了檢測和鑒定微生物的新途徑。例如:氣相色譜分析是利用微生物細(xì)胞分離的方法研究微生物分類的。其原理是將微生物細(xì)胞經(jīng)過水解、甲醇分解、提取以及硅烷化、甲基化等衍生化處理后使之分離盡可能多的化學(xué)組分供氣相色譜儀進(jìn)行分析。得到特征峰來進(jìn)行微生物鑒定。大量分析檢測各種常見細(xì)菌、酵母菌、霉菌和其他微生物的組成成分，并建立微生物組分標(biāo)準(zhǔn)色譜圖文庫，然后將待鑒定微生物的組分色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)圖譜相比較，迅速鑒定其種類［11］。

5 展望

伴隨著微生物檢測技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步，檢測的方法也越來越多樣化，除了上述介紹的幾種方法以外還包括基因芯片檢測、流式細(xì)胞術(shù)、免疫磁性微球等檢測方法。每一種檢測方法都有其自己的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，在檢測時要根據(jù)自己的實(shí)際情況選擇適合的方法，還可以適當(dāng)?shù)倪x擇幾種方法結(jié)合起來使用，以提高檢測的準(zhǔn)確性。

目前食品安全是一個重大的世界性公共衛(wèi)生問題，不僅影響到人類的健康，而且關(guān)系到國家的穩(wěn)定。雖然病菌不斷的進(jìn)化，但是檢測方法也在不斷的改進(jìn)，相信在不久的將來會研發(fā)出更加簡單快速的病原微生物檢測方法和檢測體系，為社會的飲食安全把好關(guān)，這也必將為人類的公共衛(wèi)生、營養(yǎng)健康、飲食習(xí)慣與疾病預(yù)防事業(yè)做出巨大的貢獻(xiàn)。今后食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)將會向高效率、高標(biāo)準(zhǔn)、高精準(zhǔn)度、高靈敏度的方向發(fā)展。

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