組織工程構(gòu)建人工心臟瓣膜的研究進展

馬 浩，石海燕，張 曉 綜述 王 奇 審校

心臟瓣膜病是危及人類健康的一種常見疾病，人工瓣膜置換術(shù)是其主要治療方法。目前臨床應用的人工瓣膜分為機械瓣和生物瓣兩種，均可有效改善血流動力學，但非生長性瓣膜［1］。組織工程化心臟瓣膜(tissue－engineering heart valve，TEHV)是利用組織工程技術(shù)將受體細胞種植于支架上所構(gòu)建的一種人工瓣膜，其結(jié)構(gòu)和功能與正常瓣膜相似，具有可生長性和自我修復能力，理論上能克服機械瓣和生物瓣的不足。構(gòu)建TEHV 的基本思路:采用人工合成材料或同種/異種的脫細胞心臟瓣膜作為支架，將體外擴增的自體活細胞種植于支架上，細胞黏附生長并分化，使其具備正常瓣膜組織的新陳代謝功能，從而應用于臨床。因此，TEHV 的研究包括瓣膜支架的制備、種子細胞的選擇與培養(yǎng)、細胞種植與體外預適應。近年來隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，TEHV 的研究取得一定進展。

1 瓣膜支架的制備

瓣膜支架是構(gòu)建TEHV 的基礎，理想的瓣膜支架做為細胞貼附生長的模板，不僅要提供足夠的機械強度，以承受血流沖擊所產(chǎn)生的張力和剪切力，同時又要求提供種子細胞的生長空間和微環(huán)境。因此，瓣膜支架應具備以下特性［2］:(1)足夠的力學強度，為新生組織提供支撐，直至新生組織具備自身力學特性;(2)良好的生物相容性，無明顯的致炎性、免疫原性和細胞毒性;(3)良好的材料－細胞界面，利于種子細胞黏附和增殖;(4)三維多孔立體結(jié)構(gòu)，為種子細胞提供生長空間和微環(huán)境;(5)良好的可降解性，植入體內(nèi)后的降解速度應與細胞的生長速度相匹配;(6)易于消毒。目前研究的瓣膜支架有3 種:人工高分子支架、天然高分子支架和經(jīng)脫細胞處理后的生物源性瓣膜支架［3］。

1.1 人工高分子支架 根據(jù)TEHV 支架的要求，可降解材料無疑是最好的材料。目前常用的有聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)及二者的共聚物(PLGA)等。PGA 易于吸收降解，做為細胞支架被廣泛應用于組織工程中，但PGA 缺乏結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，在組織培養(yǎng)中降解快，較難維持預先設計的形狀，而PLA、PLGA 吸收相對較慢，穩(wěn)定性相對較好，因此將PLA/PLGA 和PGA 按一定比例混合，能更好地控制降解速率和保持預設形狀。此類支架的缺點有［3，4］:(1)缺乏細胞識別位點，影響種子細胞的黏附，細胞易于脫落。為增強細胞黏附，目前發(fā)展了多種修飾技術(shù)以改善其表面特性，包括在材料表面包埋富含精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸序列的細胞外基質(zhì)成份，用氫氧化鈉處理或乙醇和水兩步預濕等。(2)機械強度不足。單純PGA 無紡網(wǎng)不具備良好的抗壓強度，通過PLA 包埋或熱處理可改善其機械強度，但仍存在抗壓強度不足的缺陷。(3)降解產(chǎn)物的致炎性。目前認為高分子支架植入體內(nèi)后可導致無菌性炎性反應，這與酸性降解產(chǎn)物引起局部PH 值下降有關(guān)，有學者將堿性物質(zhì)引入聚合物中以預防其發(fā)生。

1.2 天然高分子支架 天然高分子材料包括膠原蛋白、海藻酸酸鹽、透明質(zhì)酸等。文獻［5］報道使用纖維蛋白凝膠做為細胞支架，可以構(gòu)建完全自體來源的人工瓣膜。其特點:瓣膜結(jié)構(gòu)完全來自自體，降解速度可調(diào)節(jié)，細胞擴散更均勻等。此類支架包含生物活性物質(zhì)，利于細胞增殖;但生物力學性能較差，可塑性不強，不具備組織培養(yǎng)的立體結(jié)構(gòu)，來源有限、加工困難，限制了其實際應用。

1.3 生物源性瓣膜支架 生物源性瓣膜支架采用同種異體或異種心臟瓣膜，通過脫細胞處理消除免疫原性，并保持正常瓣膜的三維空間，既有較好的抗張強度，又能提供細胞外基質(zhì)。細胞外基質(zhì)由膠原、黏多糖和透明質(zhì)酸組成，為細胞生長提供了微環(huán)境，與種子細胞相互作用，調(diào)節(jié)各種細胞因子和生長因子的活性，間接激活細胞間的信號傳遞，促進種子細胞黏附、遷移、生長和分化［6，7］。目前此類支架在構(gòu)建TEHV 的研究中得到越來越多的關(guān)注。

此類支架有同種和異種兩類。同種支架是將同種異體細胞脫去后種植受體細胞，可有效抑制免疫反應，減慢瓣膜衰敗過程，生物學和力學特性穩(wěn)定［8］。但因同種支架取材受限，目前研究多限于肺動脈瓣，異種支架應更具研究前景。異種支架的優(yōu)點是可降低因細胞碎片而引發(fā)的瓣膜鈣化和衰敗，同時細胞黏附率也高于人工高分子支架。目前研究最多的異種支架是經(jīng)過脫細胞處理的豬主動脈瓣，在解剖形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)、組成成份和機械強度等方面和人類瓣膜相近，且來源充足。Kasimir 等［9］體外分別種植內(nèi)皮細胞和間質(zhì)細胞，結(jié)果顯示此種支架有良好的生物相容性。但Hopkins等［10］認為其易于傳染種間細菌和病毒。由于缺乏長期大規(guī)模動物實驗，目前很難評價它與高分子支架之間的優(yōu)劣。

脫細胞方法包括機械法、去污劑法和酶消化法［11］，并結(jié)合滲透溶液法進行輔助。常用去污劑有Triton X－100(聚乙二醇辛基苯基醚)、SDS(十二烷基硫酸鈉)和SD(脫氧膽酯酸鈉)，處理后的組織成份為膠原、彈性蛋白、纖維黏連蛋白和層黏連蛋白。常用消化酶為胰蛋白酶，處理后的組織成份為彈性蛋白、膠原和糖性蛋白。此外，在上述脫細胞基礎上使用核酸酶水解細胞內(nèi)的DNA 和RNA，可以減少或消除豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的污染［12］。

2 種子細胞的選擇和培養(yǎng)

種子細胞是構(gòu)建TEHV 的關(guān)鍵，理想的種子細胞應具備:(1)取材簡便;(2)體外增殖能力強;(3)能適應支架環(huán)境;(4)可通過分子生物學技術(shù)進行基因修飾。目前常用的種子細胞有:自體組織細胞、成體干細胞、胚胎干細胞和其他細胞等。早期多采用自體細胞，但受其取材限制，干細胞作為種子細胞的研究逐漸深入。

2.1 自體組織細胞 自體組織細胞包括:血管內(nèi)皮細胞、血管或皮膚的成纖維細胞或肌成纖維細胞等。從理論上看，大動脈的結(jié)構(gòu)、功能與心臟瓣膜有一定的相似性，因而動脈血管壁細胞較符合構(gòu)建TEHV 的要求，但動脈血管取材有限、創(chuàng)傷大;靜脈血管易于獲取且安全，膠原產(chǎn)生能力高于動脈血管細胞，目前已有靜脈內(nèi)皮細胞構(gòu)建TEHV 的少量報道［13］。自體組織細胞做為種子細胞也有一定的缺點，組織細胞屬于終末細胞，體外擴增能力較弱，需要犧牲大量血管才能獲得足夠細胞，其應用受到限制。

2.2 成體干細胞 成體干細胞具有自我更新和多向分化能力，有可能成為理想的組織工程種子細胞，并最終利用成體干細胞構(gòu)建出完全意義上的TEHV。目前間充質(zhì)干細胞研究最多。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)是中胚層發(fā)育的具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，易于獲取和分離，體外培養(yǎng)和增殖后多向分化潛能并不減弱，傳代后的純度可達95%以上［14］，是較為理想的TEHV 種子細胞。成人骨髓中BMMSCs 含量較少，每1 ×105的單個核細胞中有2 ～5 個BMMSCs［15］，需體外純化和擴增，方法有:全骨髓培養(yǎng)法、貼壁篩選法、免疫磁珠法和密度梯度離心法［16］。提取的BMMSCs 在誘導因子作用下能分化成骨骼、平滑肌、心肌和血管內(nèi)皮等多種組織細胞。Potapova 等［17］指出血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是誘導BMMSCs 分化為內(nèi)皮細胞的關(guān)鍵。BMMSCs 在改良Eagle's 細胞培養(yǎng)液(dulbecco’s modified eagle’s medium，DMEM)+胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的培養(yǎng)液中部分表達成纖維細胞和肌成纖維細胞的重要標志物波形蛋白和α－肌動蛋白，表明BMMSCs 有可能自然分化為成纖維細胞，但BMMSCs 在普通培養(yǎng)環(huán)境中是否能夠完全分化為成纖維細胞，目前缺乏相關(guān)研究。

2.3 胚胎干細胞 胚胎干細胞來源于囊胚的內(nèi)細胞團，可持續(xù)增殖而不分化，經(jīng)誘導后具備分化形成各類細胞的潛能。在合適的體外培養(yǎng)條件下，胚胎干細胞能分化為內(nèi)皮細胞和肌成纖維細胞，Tutter 等［18］將人的胚胎干細胞種植在鼠胚成纖維細胞飼養(yǎng)層上，胚胎干細胞自動分化為血管內(nèi)皮細胞。但目前尚不能建立無免疫原性的人胚胎干細胞系，更重要的是其研究亦受到倫理制約。

2.4 其他細胞 內(nèi)皮前體細胞(endothelial precursor cell，EPC):存在于成人骨髓及外周血中，由CD34+造血干細胞定向分化而來，VEGF 是CD34 +定向分化為EPC 的關(guān)鍵［19］。在體外可誘導形成內(nèi)皮細胞，并穩(wěn)定傳代30 代以上，表明EPC 可做為構(gòu)建TEHV 內(nèi)皮層的種子細胞。

臍血細胞:Schmidt 等［20］將臍血細胞種植于人工高分子支架后置入生物反應器中培養(yǎng)，結(jié)果顯示培育的組織具有內(nèi)皮功能并能產(chǎn)生細胞外基質(zhì)。這表明臍血細胞可以是一個新的TEHV 種子細胞來源。目前利用EPC 和人臍血細胞做為構(gòu)建TEHV 種子細胞的研究報道較少，尚無法評價其做為TEHV 種子細胞來源的可行性。

3 細胞種植與體外預適應

種子細胞在瓣膜支架上的種植受到多種因素的影響，如細胞密度、支架表面修飾、種植時間間隔、種植方式和環(huán)境等。

3.1 細胞種植 細胞在三維結(jié)構(gòu)上的分布和黏附受限于細胞重力因素，未黏附細胞會迅速脫落。提高種子細胞數(shù)量有助于細胞黏附，細胞密度多在105～106/cm2。間隔24 ～36 h重復種植明顯優(yōu)于間隔2 ～12 h 種植。

細胞與支架黏附主要由黏附因子和細胞外基質(zhì)分子相互作用介導，基質(zhì)分子包括膠原、纖維黏連蛋白(Fn)和層黏連蛋白(Ln)等。目前用Fn 和Ln 等包被支架已成為提高細胞黏附的重要手段，也可在支架表面進行固定氨基酸、多肽類物質(zhì)或細胞因子的改性處理，以提高種植效率。

細胞種植的方法有單層種植和復合種植、二維培養(yǎng)和三維培養(yǎng)、靜態(tài)培養(yǎng)和動態(tài)培養(yǎng)等。單層種植是將單類種子細胞種植在支架上，目前構(gòu)建TEHV 的研究絕大多數(shù)集中在內(nèi)皮細胞、成纖維細胞或干細胞等的單層種植上，但瓣膜組織是由內(nèi)皮細胞、間質(zhì)細胞(主要是成纖維細胞)和細胞外基質(zhì)組成，并在此基礎上發(fā)揮生理功能，因此多種細胞復合種植于支架表面上應該是構(gòu)建TEHV 的方向。復合種植分為分層種植和混合種植，前者按照瓣膜組織結(jié)構(gòu)先種植成纖維細胞、后種植內(nèi)皮細胞，后者是將這兩種細胞混合種植，細胞在支架內(nèi)遷移、重新整合成接近正常的組織結(jié)構(gòu)。目前復合種植在組織工程化人工血管和真皮的研究中取得了一定進展［21，22］，但在構(gòu)建TEHV 的研究中尚缺乏報道。

二維培養(yǎng)是將細胞置于膜性支架上，細胞形成薄層培養(yǎng)物，但長時間培養(yǎng)細胞會老化，不能構(gòu)建具有三維結(jié)構(gòu)和功能的TEHV。三維培養(yǎng)是將細胞種植于具有一定空間結(jié)構(gòu)的支架上，細胞在模擬體內(nèi)細胞的微環(huán)境中生長分化，其黏附性和生物活性明顯優(yōu)于二維培養(yǎng)。但種子細胞如何在具有空間結(jié)構(gòu)的支架表面均勻分布是目前尚待解決的問題。

目前細胞培養(yǎng)大多采用靜態(tài)的方法，由于沒有承受脈沖血流的剪切力作用，離體培養(yǎng)時間越長，細胞分化能力越差。Flanagan 等［23］研究發(fā)現(xiàn)在剪切應力作用下培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞中出現(xiàn)應力纖維，其走向與細胞長軸一致。目前認為，應力環(huán)境是細胞生長和維持正常功能的一個重要因素，據(jù)此提出了動態(tài)培養(yǎng)的方法，并設計了生物反應器，為細胞生長提供旋轉(zhuǎn)、震蕩甚至類似體內(nèi)血流的脈沖應力環(huán)境，種植后的細胞能更好地分化并維持正常生理功能。

3.2 體外預適應 研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞黏附力低，在體動物實驗中細胞易于脫落，其生理功能與正常細胞相比明顯不足，構(gòu)建的TEHV 不能達到正常瓣膜的性能要求。目前絕大多數(shù)研究者認為血流動力學環(huán)境對內(nèi)皮細胞生物學特性和生理功能的形成至關(guān)重要，可以促進細胞增殖并增強內(nèi)皮細胞和成纖維細胞的粘附能力、軸向性生長及膠原產(chǎn)生能力等生物學特性。因此體外構(gòu)建的TEHV 在植入體內(nèi)之前必須經(jīng)過模擬體內(nèi)環(huán)境的預適應，能明顯改善細胞黏附力和瓣膜生物學特性［24］。理想的脈動生物反應器應具備以下條件［25］:從生物學角度要保證細胞的生長和代謝，材料無毒，系統(tǒng)密閉，恒溫無菌;從流體力學角度要模擬體內(nèi)血流搏動，脈沖驅(qū)動，頻率、壓力和流量能逐漸上調(diào)。為模擬體內(nèi)血流的脈動，學者們進行了大量的研究，Jansson 等［26］利用鐘擺原理設計了應力培養(yǎng)系統(tǒng)，瓣膜隨鐘擺在培養(yǎng)液里往復擺動，承受類似脈動流的應力。Lichtenberg 等［27］在瓣膜支架上種植體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞，置入生物反應器中培養(yǎng)8 天后觀察，結(jié)果顯示培養(yǎng)的細胞具有分層定向能力，細胞的增殖情況也好于非生物反應器培養(yǎng)條件下的細胞。但如何保證穩(wěn)定的脈沖應力仍是目前研制生物反應器的關(guān)鍵和難點［28］。

4 TEHV 的體內(nèi)驗證

經(jīng)過體外培育和預適應的TEHV 需移植入體內(nèi)進一步觀察，以評估其各方面性能。目前TEHV 的在體實驗研究多集中于動物實驗階段，短期效果良好，但遠期效果如機械性、抗血栓、抗鈣化和耐久性等尚待進一步研究。TEHV 植入動物體內(nèi)3 ～6 個月后出現(xiàn)由中性粒細胞和巨噬細胞介導的瓣膜衰壞，但迄今為止僅少數(shù)病例應用TEHV 于臨床，無法得知植入體內(nèi)后TEHV 的組織學結(jié)構(gòu)，TEHV 距離實際應用尚有很長的研究歷程。

TEHV 作為瓣膜外科領域研究的課題，已經(jīng)取得了相當大的進展，使我們看到了臨床應用的曙光。但這一新興技術(shù)仍處于探索階段，距離實際應用尚待解決許多技術(shù)問題，例如(1)如何完全消除瓣膜支架的免疫原性及其降解產(chǎn)物的致炎性;(2)在使用脫細胞瓣膜支架中尋找更為簡單有效的脫細胞方法;(3)短期內(nèi)如何獲得大量種子細胞;(4)采用何種種植方式以提高細胞貼附;(5)研制更為接近體內(nèi)血流環(huán)境的脈沖生物反應器等。這些都要求我們在細胞生物學、分子生物學、血流動力學、材料力學等領域做出更為深入細致的研究。

［1］ Chan V，Jamieson W R，Germann E，et al. Performance of bioprostheses and mechanical pros－ theses assessed by composites of valve－related complications to 15 years after aortic valve repla－cement［J］. J Thorac Cardiovasc Surg，2006，131(6):1267－1273.

［2］ Brody S，Pandit A. Approaches to heart valve tissue engineering scaffold design［J］. J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2007，83(1):16－43.

［3］ Linda M，Ricardo P，Evert－Jan，et al. Computed Tomography Detects Tissue Formation in a Stented Engineered Heart Valve［J］.Ann Thorac Surg，2011，92(1):344－345.

［4］ Angelique B，Anita M，Marijke A.A，et al. Hypoxia Induces Near－Native Mechanical Properties in Engineered Heart Valve Tissue［J］. Circulation，2009，119(2):290－297.

［5］ Courtney T，Sacks M S，Stankus J，et al. Design and analysis of tissue engineering scaffolds that mimic soft tissue mechanical anisotropy［J］. Biomaterials，2006，27(19):3631－3638.

［6］ Lee J，Cuddihy MJ，Kotov NA. Three－dimensional cell culture matrices:state of the art［J］. Tissue Eng Part B Rev，2008，14(1):61－86.

［7］ Cen L，Liu W，Cui L，et al. Collagen Tissue Engineering:Development of Novel Biomaterials and Applications［J］. Pediatr Res，2008，63(5):492－496.

［8］ 崔 彬，劉迎龍，謝 寧，等. 去細胞組織工程同種心臟瓣膜的生物學特征［J］. 中華胸心血管外科雜志，2004，20(3):158－160.

［9］ Kasimir M T，Weigel G，Sharma J，et al.The decellularized porcine heart valve matrix in tissue engineering:platelet adhesion and activation［J］. Thromb Haemost，2005 ，94(3):562－567.

［10］ Hopkins RA. Tissue engineering of heart valves:decellularized valve scaffolds［J］. Circulation，2005，111(21):2712－2714.

［11］ Knight R L，Wilcox H E，Korossis S A，et al. The use of acellular matrices for the tissue engi－neering of cardiac valves［J］.Proc Inst Mech Eng，2008，222(1):129－143.

［12］ 顧春虎，劉維永，劉 洋，等. 不同試劑脫除豬主動脈瓣細胞的對比研究［J］. 中華胸心血管外科雜志，2006，22(2):127－129.

［13］ Sievers HH. In vivo tissue engineering an autologous semilunar biovalve:can we get what we want?［J］. J Thorac Cardiovasc Surg，2007，134(1):20－22.

［14］ 付建華，趙 曼，杜桂英，等. 應用骨髓干細胞和自制膠原－殼聚糖構(gòu)建組織工程心瓣膜［J］. 第三軍醫(yī)大學學報，2011，33(2):152－155.

［15］ Schink?the T，Bloch W，Schmidt A. In vitro secreting profile of human mesenchymal stem cells［J］. Stem Cells Dev. 2008，17(1):199－206.

［16］ Bernacki SH，Wall ME，Loboa EG. Isolation of human mesenchymal stem cells from bone and adipose tissue［J］. Methods Cell Biol，2008;86:257－78.

［17］ Potapova I A，Gaudette G R，Brink P R，et al. Mesenchymal stem cells support migration，extra－ cellular matrix invasion，proliferation，and survival of endothelial cells in vitro ［J］. Stem Cells. 2007，25(7):1761－1768.

［18］ Tutter AV，Baltus GA，Kadam S. Embryonic stem cells:a great hope for a new era of medicine. Curr Opin Drug Discov Devel，2006，9(2):169－175.

［19］ Fang N T，Xie S Z，Wang S M，et al. Construction of tissue－engineered heart valves by using decellularized scaffolds and endothelial progenitor cells［J］.Chin Med J (Engl)，2007，120(8):696－702.

［20］ Schmidt D，Mol A，Odermatt B，et al. Engineering of biologically active living heart valve leaflets using human umbilical cord－derived progenitor cells［J］.Tissue Eng，2006，12(11):3223－3232.

［21］ Takei T，Yamaguchi S，Sakai S，et al. Novel technique for fabricating double－layered tubular constructs consisting of two vascular cell types in collagen gels used as templates for three－ dimensional tissues［J］. J Biosci Bioeng，2007，104(5):435－438.

［22］ Priya S G，Jungvid H，Kumar A. Skin tissue engineering for tissue repair and regeneration［J］. Tissue Eng Part B Rev，2008，14(1):105－118.

［23］ Flanagan T C，Cornelissen C，Koch S，et al. The in vitro development of autologous fibrin－based tissue－engineered heart valves through optimised dynamic conditioning［J］. Biomaterials，2007，28(23):3388－3397.

［24］ Becker S，Saint－Cyr M，Wong C，et al. AlloDerm versus DermaMatrix in immediate expander－based breast reconstruction:a preliminary comparison of complication profiles and material compliance［J］. Plast Reconstr Surg，2009;123(1):1－6.

［25］ Engelmayr G C，Hildebrand D K，Sutherland F W，et al. A novel bioreactor for the dynamic flexural stimulation of tissue engineered heart valve biomaterials［J］. Biomaterials，2003，24(14):2523－2532.

［26］ Jansson K，Bengtsson L，Swedenborg J，et al. In vitro endothelialization of bioprosthetic heart valves provides a cell monolayer with proliferative capacities and resistance to pulsatile flow［J］. J Thorac Cardiovasc Surg，2001，121:108－115.

［27］ Lichtenberg A，Cebotari S，Tudorache I，et al. Flow－dependent re－ endothelialization of tissue－engineered heart valves［J］. J Heart Valve Dis，2006，15(2):287－293.

［28］ Mol A，Driessen N J，Rutten M C，et al. Tissue engineering of human heart valve leaflets:a novel bioreactor for a strain－based conditioning approach ［J］. Ann Biomed Eng，2005，33(12):1778－1788.