微生物胞外聚合物的研究進(jìn)展

皋德祥，鄧歡歡，張明華，3，葛利云，王紅武

（1.溫州醫(yī)學(xué)院 水域科學(xué)與環(huán)境生態(tài)研究所，浙江 溫州 325035；2.同濟(jì)大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092；3.University of California，Land，Air and Water Resources Department，Davis，CA 95616)

微生物胞外聚合物的研究進(jìn)展

皋德祥1，鄧歡歡1，張明華1，3，葛利云1，王紅武2

（1.溫州醫(yī)學(xué)院 水域科學(xué)與環(huán)境生態(tài)研究所，浙江 溫州 325035；2.同濟(jì)大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092；3.University of California，Land，Air and Water Resources Department，Davis，CA 95616)

微生物；胞外聚合物；特性；提取方法；組成；綜述文獻(xiàn)

胞外聚合物（extracellular polymeric substance，EPS）是一類有機(jī)高分子多聚化合物，相對分子量分布在1×104～3×104之間，它是在特定的生存條件下微生物新陳代謝過程中產(chǎn)生的胞外物質(zhì)。這類物質(zhì)可以起到對微生物自身的保護(hù)和它們之間相互附著的作用，而且在微生物缺乏營養(yǎng)的條件下可以為其提供營養(yǎng)來源[1]。EPS在微生物群體中廣泛存在，EPS有一些獨(dú)特的性能，使EPS的研究越來越受到人們的重視。

國內(nèi)外研究者對EPS開展了大量的研究。本綜述對EPS的組成、結(jié)構(gòu)、特性、提取方法、成分分析、儀器分析等進(jìn)行了概述，并綜合介紹了其在實(shí)際工程中的應(yīng)用范圍、現(xiàn)有發(fā)展及今后的研究趨勢，為EPS今后更深入的分析研究提供基礎(chǔ)資料。

1 EPS的概述

1.1 EPS的組成 EPS的組成成分比較多樣，其組分因其來源微生物的不同也有差異，但總的來說，EPS由蛋白質(zhì)、多糖、核酸、糖醛酸[2]、脂類、腐殖酸[3]、氨基酸等組成。蛋白質(zhì)和多糖是其主要成分，占EPS總量的70%～80%[4]。其次，很多的外界因素也會影響EPS各組分的比例，如吳志高[5]研究了增加進(jìn)水中的碳源含量而氮、磷相對缺乏的情況下對污泥EPS的影響，當(dāng)比較反應(yīng)器內(nèi)BOD5/TP值為100/0這種極限狀態(tài)和BOD5/TP值為100/1.2的正常狀態(tài)時發(fā)現(xiàn)，前者污泥EPS中各種成分的含量有了不同程度的增大：多糖含量由12.12 mg/gVSS驟升至32.92 mg/gVSS，增幅達(dá)172%；蛋白質(zhì)含量由9.43 mg/gVSS增加13.37 mg/gVSS，增加了42%；DNA含量由5.72 mg/gVSS增加到13.80 mg/gVSS，增加了141%；EPS總量由27.28 mg/gVSS增加到60.09 mg/gVSS，增加了120%。

目前，研究者的研究重點(diǎn)主要集中在EPS中主要成分——多糖類和蛋白質(zhì)，而對EPS中其他成分的研究和應(yīng)用相對較少。

1.2 EPS的結(jié)構(gòu) 微生物EPS可分為溶解性EPS（soluble EPS，sEPS）和結(jié)合態(tài)EPS（bound EPS，bEPS）。sEPS是微生物新陳代謝、自溶等生成的游離態(tài)大分子物質(zhì)[6]。bEPS是具有有流變性的雙層結(jié)構(gòu)物質(zhì)，是由緊密附著的內(nèi)層（tightly bound EPS，TEPS，TP）和疏松附著的外層（loosely bound EPS，LEPS，LP）組成[7]。

1.3 EPS的特性 EPS有以下一些特性，這些特性是其能被廣泛研究應(yīng)用的重要原因：①表面電負(fù)性：EPS一般都是呈電負(fù)性，這是因?yàn)槠浣M成結(jié)構(gòu)上存在帶負(fù)電性的基團(tuán)多于帶正電性的基團(tuán)，這些帶電基團(tuán)的電量其絕對值一般分布于0.2～0.6 meq·g-1MLSS[8]。②吸附性：EPS的吸附性歸功于其成分大都是表面積很大的大分子物質(zhì)，同時這些物質(zhì)表面也存在多種非極性和極性的官能團(tuán)，其中多糖類物質(zhì)在EPS吸附作用中起重要的作用[9]。③絮凝性：EPS的絮凝性主要是其成分的大基團(tuán)的作用，表現(xiàn)在這些大的官能團(tuán)在適合的條件下與溶液中懸浮顆粒通過離子鍵、氫鍵作用相結(jié)合而形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而沉淀[10]。④親水疏水性：EPS中的蛋白質(zhì)、腐殖質(zhì)、尿酸是疏水性組分，而多糖類則是親水性的主要成分[11]。EPS的親水疏水性也受眾多條件的影響，龍騰銳等[12]研究發(fā)現(xiàn)SRT為15 d的TEPS比較于3 d的TEPS有更強(qiáng)的疏水性。

此外，EPS也能穩(wěn)定絮凝體的結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞外形成保護(hù)層抵御殺菌劑和有毒物質(zhì)等的危害，保持細(xì)胞水分，富集營養(yǎng)物質(zhì)等重要的一些生理功能[13-14]。最近也有研究者發(fā)現(xiàn)EPS能對防止金屬腐蝕起到一定的功效。

2 EPS的提取

微生物EPS不同提取方法的結(jié)果對微生物細(xì)胞或者EPS的屬性表達(dá)具有不同的影響[15]，同時也決定了EPS的組分、干重[16]、含量及提取效率等，因此選擇合理的提取方法非常重要。

理想的EPS提取方法應(yīng)該滿足以下3個條件：①對EPS的組分功能不會產(chǎn)生破壞或產(chǎn)生的破壞極?。虎谀軌颢@得純化效果好的成分；③具有比較高的提取效率[1]。

EPS的提取方法大體上可以分為物理提取法、化學(xué)提取法和物理-化學(xué)聯(lián)合提取法三大類。這樣的分類方法是基于化學(xué)試劑是否在EPS與細(xì)胞膜分離的過程中起作用而提出的。

物理提取法的主要原理是利用外加力量來提高EPS中各種成分在液體中的溶解度，常用的有超聲波法、超聲離心法、蒸汽提取法、常規(guī)高速離心提取法、熱提取法等[17]。物理提取法具有不添加化學(xué)試劑、EPS的生物活性成分破壞小、比較平和的優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是EPS提取量較少。因此，物理提取方法比較適用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程中EPS的光譜、吸附等靈敏度要求高、EPS官能團(tuán)結(jié)構(gòu)變異小的實(shí)驗(yàn)類型，而對于要求提取大量的EPS則不是理想的方法。

化學(xué)提取法主要原理是試劑中的離子或分子利用生物膜的內(nèi)傳質(zhì)作用進(jìn)入生物膜后試劑與EPS相接觸而成為水溶性混合物而達(dá)到提取目的，常用的有氫氧化鈉提取法、乙醇提取法、乙二胺四乙酸（EDTA）提取法、磷酸緩沖溶液提取法、三羥甲基氨基甲烷/鹽酸（Tris/HCl）提取法、陽離子交換樹脂提取法（CER）、甲醛-氫氧化鈉提取法、戊二醛提取法、硫酸提取法等[18-20]?；瘜W(xué)提取法一般具有提取量大的優(yōu)點(diǎn)，但化學(xué)提取法容易造成細(xì)胞的死亡破裂，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外流而使提取的EPS有胞內(nèi)雜質(zhì)，影響提取結(jié)果進(jìn)而影響后續(xù)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[1]。

綜合考慮物理提取法和化學(xué)提取法的優(yōu)缺點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)研究的實(shí)際需要，優(yōu)化和組合成合適的物理-化學(xué)聯(lián)合法不失為一種合適的方法[1]。物理化學(xué)法有超聲波-陽離子樹脂法[15]、超聲波-甲醛法[21]等。在實(shí)際應(yīng)用時把兩種方法的契合點(diǎn)找好，將會大大提高提取的效果。

目前EPS的提取的微生物對象大體可以認(rèn)為是生物膜、活性污泥膜和細(xì)菌三種類型[22]。

物理法和化學(xué)法均適用于生物膜的EPS的提取。目前對生物膜的提取大多采用化學(xué)法，不過化學(xué)法會破壞細(xì)胞而造成核酸含量大增，因此，加入的化學(xué)試劑的濃度不能過高。葛利云等[23]通過研究發(fā)現(xiàn)活性污泥膜EPS的提取大多是也利用了生物膜的提取原理。常用的活性污泥膜的EPS提取法有：加熱提取法、超聲波提取法、陽離子交換樹脂法，也常用一些組合方法，如甲醛-NaOH法、超聲波-陽離子交換樹脂法等。

研究者研究從細(xì)菌細(xì)胞中提取EPS大多數(shù)還是采用化學(xué)法（如EDTA或甲醛法）和物理法（如超聲波或陽離子樹脂法）。但在這些方法之中，有人通過儀器分析發(fā)現(xiàn)超聲波等并不能完全使EPS從細(xì)胞表面脫落，而化學(xué)試劑又會造成細(xì)胞破裂而影響提取結(jié)果，因此，陽離子樹脂提取法較為合適[24]。除此以外，國內(nèi)外很多研究都采用一種提取工藝：選擇菌種-液體培養(yǎng)基培養(yǎng)-機(jī)械離心-藥品醇析-低溫凍干，這樣提取出的EPS有助于對其做更深入的研究。

3 EPS的特性分析

研究者用各種提取方法從微生物中提取EPS后，要對提取出來的EPS的提取效率、提取方法、結(jié)構(gòu)、特性、成功率、EPS的實(shí)際應(yīng)用范圍等進(jìn)行評價，這些評價可以通過對提取出來的EPS進(jìn)行特性分析得以實(shí)現(xiàn)。

3.1 EPS的組成成分分析 EPS主要成分的測量方法將影響提取的EPS含量的評價，其組分的測量常采用分光光度法。分光光度法通常是通過消解樣品中的待測成分，將成分變成水解產(chǎn)物后投加顯色劑，水解產(chǎn)物與顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)，根據(jù)顯色反應(yīng)的顏色深淺程度來測定樣品中成分的含量。不過測定這些物質(zhì)含量的方式較多，如加何種顯色劑、加多少量、用何種波長來監(jiān)測其顯色的程度等。目前尚未有確定的測定標(biāo)準(zhǔn)，不同測定方法對測定結(jié)果的影響較大，因此，在研究其成分含量時，一定要結(jié)合操作、可靠性、準(zhǔn)確性等方面進(jìn)行綜合考慮。

多糖的測定常采用蒽酮比色法[25]、苯酚硫酸比色法[25]、紫外-可見分光光度法[37]等；蛋白質(zhì)的測定方法通常有凱氏定氮法[25]、雙縮脲法[25]、Folin-酚試劑法（Folin-Lowry法）[25]、修正后的Folin-Lowry法[25]、考馬斯亮蘭法（Bradford法）[25]、紫外吸收法[26]等；核酸（DNA）含量的分析可以采用熒光分析（DAPI法）[25]、定磷法[25]、紫外吸收法[25]、二苯胺比色法[40]；腐殖質(zhì)的測定目前還是采用修正后的Lowry法[25]居多；糖醛酸的測定方法有間羥基聯(lián)苯硫磺酸法[25]、硫酸咔唑法[27]。

不同的檢測方法適合不同的樣品，并且對EPS的提取方法評價及其成分的表達(dá)等有不同的影響。Benetti[28]采用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用蒽酮法和硫酸-苯酚比色法分別測量含有50 g的葡聚糖、黃原膠、褐藻酸的樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用蒽酮法比硫酸-苯酚法有更高的檢測效果。

3.2 EPS的儀器分析 某些情況下，如觀察EPS在細(xì)胞外分布、結(jié)構(gòu)、絮凝的效果、電負(fù)性、吸附前后形態(tài)、酶處理前后形態(tài)等性質(zhì)時，需要通過一些先進(jìn)儀器方法進(jìn)行分析。目前國內(nèi)外對EPS的結(jié)構(gòu)特性、表面形態(tài)等分析和研究主要采用三維熒光光譜技術(shù)（3DEEM）、掃描電鏡（SEM）[29]、傅里葉紅外光譜儀（FTIR）、飛行時間質(zhì)譜（TOFMS）、激光共聚焦顯微鏡（CLSM）[21]與不同熒光探針聯(lián)合、能譜儀、核磁共振（NMR）、微相吸附-光譜修正技術(shù)（MSASC）-剛果紅（Congo Red，CR）探針聯(lián)合[30]、能譜儀、磁共振（NMR）等先進(jìn)儀器方法。熊芬等[31]采用陽離子交換樹脂法提取煙曲霉EPS，通過FTIR分析表明，多聚糖中的羥基、羧基和C—O—C等官能團(tuán)是與Pb2+發(fā)生作用的基團(tuán)，而其中蛋白質(zhì)發(fā)生的作用不明顯。

4 EPS的實(shí)際應(yīng)用

鑒于微生物EPS眾多特性，隨著生物技術(shù)在各領(lǐng)域的不斷發(fā)展和應(yīng)用，EPS在相應(yīng)的實(shí)際工程中已得到了廣泛的應(yīng)用。

4.1 在廢水處理方面 目前，EPS在環(huán)境工程中的應(yīng)用主要是體現(xiàn)在去除廢水中的重金屬方面，EPS在應(yīng)用的過程中起到了絮凝劑、絡(luò)合劑等作用。研究者們對于EPS去除廢水中金屬離子的機(jī)制，提出了不同的觀點(diǎn)，主要可以歸納為以下幾點(diǎn)：①先期沉淀的金屬離子被生物膜的絮凝物捕獲；②EPS與可溶性金屬離子成鍵；③細(xì)胞吸收積累可溶性金屬；④使金屬通過向大氣中揮發(fā)而達(dá)到去除的效果[32]。

微生物的EPS去除重金屬離子具有許多潛在的優(yōu)點(diǎn)：①在污水中仍然可以有效地去除金屬離子。②在低濃度的情況下，少量菌體生物量也能有效地去除金屬離子。③微生物的EPS是可利用的天然可再生的生物物質(zhì)，環(huán)?？沙掷m(xù)。④具有處理水中多種金屬離子的能力，具有多重性[33]。Zhang等[34]通過熒光光譜技術(shù)（EEM）發(fā)現(xiàn)，微生物EPS中的可溶性有機(jī)物對汞（II）有很好的吸附能力。

此外，EPS還能影響污泥的絮凝和沉降起作用，對污泥的吸附性能有影響，也能對生物除磷等方面發(fā)揮作用[35]。不過EPS在環(huán)境工程水處理方面是造成膜生物反應(yīng)器（MBR）中膜污染的主要物質(zhì)，膜的主要污染形式為胞外多糖在膜表面的沉積[36]。但是，通過研究污染機(jī)制采用一定的優(yōu)化措施是可以達(dá)到有效防治或減緩EPS對膜污染，從而達(dá)到提高膜處理廢水的效率。

4.2 在礦物冶金方面 在礦物冶金工程上，很多國內(nèi)外研究者參考了環(huán)境領(lǐng)域有關(guān)微生物EPS在處理重金屬廢水方面的研究機(jī)制，在礦物浮選過程中利用了微生物EPS的絮凝性、吸附性等。細(xì)菌EPS在鍵合金屬離子方面有選擇性，但多數(shù)情況下，起關(guān)鍵作用的大分子類型還未確定。研究顯示，多糖具有較強(qiáng)的金屬固定能力，蛋白質(zhì)也具有金屬離子鍵合作用[37]。

EPS在礦物冶金中主要有3種作用形式：①幫助加快礦物體在水溶液中溶解；②改變礦物表面化學(xué)性質(zhì)；③吸附冶金廢水中的金屬離子[18]。

4.3 在醫(yī)藥生物方面 醫(yī)藥生物工程中對EPS的研究和應(yīng)用主要集中在EPS的主要成分——多糖的生物活性功能、活血化瘀作用與免疫保健作用方面。研究者將EPS的多糖應(yīng)用于生物醫(yī)藥工程至今，發(fā)現(xiàn)了諸如抗腫瘤作用、對免疫功能的影響、實(shí)驗(yàn)性微循環(huán)障礙的保護(hù)作用、抗血栓作用、抗內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用、抗凝血作用[38]、降血糖作用、抗衰老作用、抗輻射作用、抗病毒作用、預(yù)防和治療腫瘤及艾滋病等生物活性[39]。

對于胞外多糖在生物醫(yī)學(xué)方面的研究大都集中從細(xì)菌藻類中提取的，而微生物其他方面的研究似乎不多。EPS及其主要成分會在生物醫(yī)藥領(lǐng)域得到越來越廣泛的應(yīng)用。朱長亮等[32]認(rèn)為主要將體現(xiàn)在以下幾個方面：①用于綠色生物試劑的研制；②用于環(huán)保保健藥品的生產(chǎn)；③用于對暫時不能有效治療的頑疾的研究。

4.4 在食品加工方面 食品加工業(yè)中對EPS主要是利用其中的多糖類。胞外多糖可以用作食品添加劑、穩(wěn)定劑、抗凝劑、保鮮劑、調(diào)味劑等，已經(jīng)獲得實(shí)際應(yīng)用的有結(jié)冷膠、黃原膠[32]、海藻糖[40]等。黃原膠在啤酒中作泡沫穩(wěn)定劑，在奶酪和冷凍食品中作凍融穩(wěn)定劑，在肉制品加工中作保鮮劑，在果醬和糖漿等中作增稠劑等。結(jié)冷膠作為一種新的生物食品添加劑具有用量少、性能更加穩(wěn)定、凝結(jié)度高、凝膠清亮和呈味性能優(yōu)良等優(yōu)點(diǎn)。海藻糖被用作可以應(yīng)用到各種各樣的食品和調(diào)味料等中，從而可以大大改善食品的質(zhì)量并增加食品的花色品種，促進(jìn)食品工業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。

EPS及其主要成分會越來越多地在食品工業(yè)中被應(yīng)用主要將體現(xiàn)在以下幾個方面：①開發(fā)綠色環(huán)保的食品；②用于糖果、無油蛋糕、冰激凌等產(chǎn)品的生產(chǎn)；③作為優(yōu)良的天然的食品調(diào)味劑，改善食品的口感，增加食品的風(fēng)味；④用作綠色環(huán)保的保鮮劑、干燥劑、防腐劑。

4.5 在生態(tài)、修復(fù)方面 EPS的主要成分胞外多糖，它們對土壤的形成可能是很重要的，因?yàn)樗鼈兡鼙３滞寥罎駶?，而且由于具有很好的黏性，可以將土壤顆粒聚積在一起，防止水和風(fēng)的侵蝕[40]。Mazor等[41]研究表明，藍(lán)藻胞外多糖在荒漠微生物結(jié)皮中起關(guān)鍵作用，一方面能在夏季7-8月保持土壤濕潤，另一方面能保護(hù)結(jié)皮的微生物群落。這樣EPS對沙漠治理方面能起到重要的作用。

在稻田中一些藻類能產(chǎn)生的大量胞外蛋白聚糖，可以形成黏質(zhì)或膠質(zhì)，在旱季時固定水分。以這種方式保持的土壤水分可以被水稻利用，這樣在有些地區(qū)可以延長水稻的生長季節(jié)，使更多的植株成熟，從而提高產(chǎn)量。因此，在水稻田中EPS對于提高土壤的營養(yǎng)水分有很大的幫助[39]。

在其他類如化妝品工業(yè)（懸浮劑、乳化劑）、紡織（印染）工業(yè)（絮凝劑脫色）和石油工業(yè)（增強(qiáng)石油回收）等其他領(lǐng)域內(nèi)也有廣泛的應(yīng)用。

5 前景與展望

今后隨著生物科技的普及以及儀器設(shè)備的日益發(fā)展，人們對微生物EPS的研究、認(rèn)識將會不斷深入，應(yīng)用領(lǐng)域?qū)斓赝卣?。筆者認(rèn)為微生物EPS以后的研究重點(diǎn)將集中在以下幾個方面：①有目的篩選出高產(chǎn)EPS的微生物，尋找先進(jìn)技術(shù)方法（如基因技術(shù)），優(yōu)化培養(yǎng)條件，大批量提取目的EPS，能夠在量和質(zhì)上突破EPS現(xiàn)有的研究和使用水平。②對EPS現(xiàn)有的單一的物理、化學(xué)提取方法過程進(jìn)行完善，能夠開發(fā)整合出更多物理化學(xué)聯(lián)合提取技術(shù)。研究出更多更新的物理、化學(xué)及物理化學(xué)聯(lián)合技術(shù)，從生物技術(shù)方面尋找突破，能夠開發(fā)出生物方法提取出EPS。③能夠針對EPS建立一套標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的提取方法和評價方法，以便使不同研究者對不同EPS載體的研究能夠建立在更加統(tǒng)一、有效、合理、有比較的平臺上。④尋找并整合出針對不同微生物的EPS組成成分的分析方法，建立更有效的儀器分析方法，為描述EPS的主要成分和特性提供更多的理論依據(jù)。⑤研究利用EPS更多的潛在功能?，F(xiàn)有的實(shí)際工程應(yīng)用大都利用了EPS的主要成分——胞外多糖的成分特性，對于EPS的其他成分——蛋白質(zhì)、核酸、糖醛酸等的利用卻很少提及，因此，對其他成分的特性應(yīng)用可以增加研究的力度。這樣能夠?qū)PS的所有成分更有效的應(yīng)用，并可突破現(xiàn)有應(yīng)用領(lǐng)域的范圍，在新的領(lǐng)域中替代傳統(tǒng)的產(chǎn)品。⑥消除EPS在實(shí)際應(yīng)用過程中的消極作用，如進(jìn)一步研究生物運(yùn)行條件對活性污泥中EPS含量的影響，確定EPS含量對MBR性能影響最小的生物運(yùn)行條件。

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X172

C

1000-2138（2012）03-0297-05

2011-12-08

國家自然科學(xué)基金資助項目（51108351）；國家自然科學(xué)基金資助項目（51108350）；國家自然科學(xué)基金資助項目（51078282）。

皋德祥（1987-），男，江蘇鹽城人，碩士生。

葛利云，副教授，Email：glymail@163.com。

吳健敏）

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