尖葉胡枝子青貯微生物數(shù)量變化及發(fā)酵特性

司丙文，王宗禮，孫啟忠，張慧杰，李 峰

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081;

2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

尖葉胡枝子(Lespedezahedysaroides)為豆科多年生草本狀半灌木[1]，廣泛分布于我國東北、華北、西北、西南、華南等地，具有耐干旱、耐貧瘠、抗寒、病蟲害少等特性，是良好的水土保持和防止沙化的生態(tài)型牧草[2]。該牧草莖葉的粗蛋白、氨基酸、粗纖維等營養(yǎng)成分含量高，年生物量大，又是優(yōu)良的飼用牧草。尖葉胡枝子資源豐富，但由于木質(zhì)化程度高，適口性差，目前為止尚未得到合理的開發(fā)利用。青貯作為青綠飼料的有效貯藏手段，不僅能有效保存原料的營養(yǎng)價值，而且通過乳酸發(fā)酵能改善適口性，提高營養(yǎng)價值。然而，尖葉胡枝子含糖量比較少，緩沖能值高，是一種很難青貯的原料。近年來，青貯菌劑以及纖維素酶已經(jīng)廣泛應(yīng)用在難青貯的豆科牧草中，并得到了良好的效果[3-6]。本研究分析了尖葉胡枝子表面附生的乳酸菌的種類及其產(chǎn)酸能力，并通過添加乳酸菌制劑和纖維素酶進(jìn)一步研究青貯過程中微生物數(shù)量動態(tài)變化及青貯發(fā)酵品質(zhì)，探討適合尖葉胡枝子青貯的可行方法，為生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1青貯原料 2010年7月采自內(nèi)蒙古赤峰市林西縣良種場人工種植的尖葉胡枝子，取樣時期為第1茬開花期。

1.2青貯添加劑 SNOW LACT-L：主要成分為鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)凍干粉，生產(chǎn)商為Snow Brand Seed Co.,Ltd,Sapporo,Japan。

纖維素酶：Acremonium cellulase粉劑，生產(chǎn)商為Meiji Seika Kaisha Ltd，Tokyo，Japan。羧甲基纖維素酶(CMCase),酶活性為27 000 U·g-1；β葡萄糖苷酶(β-glucosidase),酶活性為780 U·g-1；微結(jié)晶纖維素酶(Avicelase),酶活性為784 U·g-1；木聚糖酶(Xylanase),酶活性為13 000 U·g-1。

1.3試驗設(shè)計 試驗設(shè)添加乳酸菌(SL)、纖維素酶(AC)、乳酸菌和纖維素酶混合添加(SL+AC)以及不添加對照組(Control)4個處理，每個處理3次重復(fù)。乳酸菌和纖維素酶的添加量分別為0.000 5%和0.001 5%。

1.4青貯調(diào)制 尖葉胡枝子用粉碎機(jī)粉碎為2～3 cm，按照試驗設(shè)計加入添加劑，添加量以鮮質(zhì)量為基礎(chǔ)，裝入聚乙烯袋，每袋質(zhì)量約200 g，用真空包裝機(jī)抽真空并封口，在室溫條件下分別貯藏2、5、10和30 d后開封取樣，進(jìn)行微生物計測，青貯60 d分析青貯的發(fā)酵品質(zhì)、化學(xué)成分。

1.5微生物菌數(shù)的計測 在超凈工作臺中將待測樣品開封取樣，將樣品剪碎，混勻，稱取5 g于裝有45 mL無菌水的100 mL三角瓶中，搖床180 r·min-1，室溫振蕩30 min，將此溶液依次稀釋10～109倍。用平板培養(yǎng)計數(shù)法進(jìn)行菌數(shù)計測。MRS培養(yǎng)基在37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h，BLB、PDA、NA培養(yǎng)基在37 ℃有氧條件下培養(yǎng)48 h后計數(shù)。

1.6乳酸菌生化特性試驗與糖發(fā)酵試驗 選取從新鮮尖葉胡枝子上分離純化的2株乳酸菌，進(jìn)行溫度、耐酸耐鹽、葡萄糖產(chǎn)氣等生化試驗和糖發(fā)酵試驗[7-9]，將這2株乳酸菌進(jìn)行初步鑒定。

1.7乳酸菌16S rRNA 基因序列測定及系統(tǒng)進(jìn)化分析 對菌株16S rRNA 基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為27 f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1 492 r：5′-AAGTCGTAACAAGGTAACC-3′，由上海桑尼生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：Sapphire Amp Fast PCR Master Mix (購自日本株式會社)25 μL，引物27 f和1 492 r(20 pm)各2 μL，ddH2O 補(bǔ)足至50 μL，挑取培養(yǎng)24～48 h的乳酸菌單菌落于反應(yīng)體系中混勻；PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)后，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行正、反測序。序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性比對，用Mega 4.0軟件分析菌株與參考菌種親緣關(guān)系，利用軟件中的cluster W 方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.8產(chǎn)酸速率測定 將分離并鑒定的乳酸菌分別按3%的接種量傳入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)。每隔2 h測定不同菌株發(fā)酵液pH值[10]。

1.9生長曲線的測定 用待測菌株24 h的培養(yǎng)液，以3%的接種量接入MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，每隔2 h取一次樣品，放于4 ℃冰箱中，最后以培養(yǎng)基為空白，在620 nm下測定樣品的吸光度值，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，相對應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.10青貯發(fā)酵化學(xué)成分測定 取青貯樣品20 g，加入180 mL去離子水中，攪拌搖勻，放入4 ℃冰箱中靜置24 h，取出用4層粗紗布過濾到燒杯中，再用定量濾紙過濾到三角瓶中，再用pH測定儀(雷磁PHS-3C)測定濾液pH值；采用滴定法測定青貯原料的緩沖能[11]；采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定氨態(tài)氮(NH3-N)含量[12]；采用烘箱干燥法測定干物質(zhì)(DM)含量；采用凱氏定氮法測定粗蛋白質(zhì)(CP)含量[13]；采用范氏洗滌纖維法測定中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)含量[14]；采用蒽酮-硫酸比色法測定可溶性碳水化合物(WSC)含量[15]；使用SHIMADZE-10A型高效液相色譜儀檢測濾液中的乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量[16]。青貯飼料品質(zhì)評價采用弗氏Flieg評分法[17-18]。

1.11數(shù)據(jù)分析 基礎(chǔ)數(shù)據(jù)整理用Excel軟件，用SAS(12.0版)軟件程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1分離乳酸菌生化鑒定 從新鮮尖葉胡枝子材料中分離出2株乳酸菌，分別編號為LH29和LH33，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)LH29為球菌，LH33為桿菌。對這2株乳酸菌進(jìn)行生化試驗(表1)和糖發(fā)酵試驗(表2)。菌株LH29革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性，發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣，屬同型乳酸發(fā)酵類型，45 ℃生長，可發(fā)酵葡萄糖、木糖、果糖、熊果甘、核糖、海藻糖，不能發(fā)酵山梨醇，與戊糖片球菌發(fā)酵特性相似，故將LH29初步鑒定為戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)[19]。菌株LH33革蘭氏陽性，能夠發(fā)酵苦杏仁甙、纖維二糖、七葉靈、果糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘露糖、甘露醇、蜜二糖、棉籽糖、核糖、山梨醇、蔗糖和海藻糖，不能發(fā)酵鼠李糖，與植物乳桿菌發(fā)酵特性相似，故將LH33初步鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillisplantarum)。

表1 分離菌株生理生化特性

2.2分離菌株16S rRNA 基因序列分析 菌株LH29和LH33經(jīng)PCR擴(kuò)增所獲得的16S rRNA 基因部分序列長度分別為1 481和1 474 bp。在GenBank中進(jìn)行16S rRNA基因同源性序列比對，結(jié)果顯示，分離菌株LH29與多株P(guān).pentosaceus菌株的16S rRNA 基因序列相似性均達(dá)99%，與菌株P(guān).pentosaceusMJK7(登錄號AB494722.1)的同源性達(dá)100%；經(jīng)比對菌株LH33與多株L.plantarum菌株的16S rRNA 基因序列相似性均超過99%，利用MEGA4.0 軟件將分離菌株與部分參考菌株(表3)基于16S rRNA 基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)，結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)及生化特性，可將菌株LH29和LH33分別鑒定為戊糖片球菌和植物乳桿菌。

2.3分離菌株產(chǎn)酸速率和生長速度比較 菌株LH29和LH33是從新鮮的尖葉胡枝子上分離的兩株乳酸菌，它們的產(chǎn)酸能力和生長速度對青貯品質(zhì)有很大影響。比較LH29和LH33的產(chǎn)酸速率(圖2)發(fā)現(xiàn)，0～4 h LH29的pH值下降的速度略快于LH33，而LH33在發(fā)酵6～12 h pH值下降趨勢比LH29更為明顯，LH33和LH29在發(fā)酵12 h后的pH值分別達(dá)到4.2和4.4。

菌株LH29和LH33生長迅速，幾乎觀察不到遲緩期(圖3)，很快進(jìn)入對數(shù)生長期(2～8 h)，10 h后生長趨于平緩，進(jìn)入生長穩(wěn)定期，培養(yǎng)到36 h未見到衰退期。比較而言，對數(shù)生長時期LH29生長速度較LH33快，對應(yīng)產(chǎn)生乳酸較多，pH值下降較快；而進(jìn)入生長穩(wěn)定期后，菌株LH33的吸光值高于LH29，同時對應(yīng)的LH33的pH值也要低于LH29。

表2 分離株菌的糖發(fā)酵結(jié)果

圖1 分離菌株16S rRNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖2 分離株菌產(chǎn)酸速率曲線

圖3 分離株菌生長曲線

表3 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的乳酸菌參考菌株

表4 尖葉胡枝子青貯發(fā)酵過程中微生物數(shù)量的變化

在設(shè)定的試驗條件下，菌株LH33的生長情況和產(chǎn)酸能力比LH29要好。

2.4青貯過程中微生物數(shù)量的變化 自然條件下生長的飼草表面附生著大量微生物，試驗測得每克尖葉胡枝子上附生的乳酸菌數(shù)量為3.70 cfu，好氧細(xì)菌為5.60 cfu，酵母菌與霉菌為6.65 cfu，大腸桿菌為3.90 cfu，乳酸菌的數(shù)量遠(yuǎn)少于霉菌、酵母、好氧細(xì)菌以及大腸桿菌的數(shù)量，原料表面附生的乳酸菌數(shù)均未達(dá)到良好發(fā)酵所需的105cfu·g-1的最低水平[20]。尖葉胡枝子發(fā)酵過程中微生物數(shù)量的動態(tài)變化如表4所示，在發(fā)酵第2天，添加AC處理組的乳酸菌數(shù)量最多，SL+AC添加組的乳酸菌的數(shù)量顯著高于對照組(P<0.05);第5天，AC添加組乳酸菌數(shù)量下降很快，顯著低于其他添加組及對照組(P<0.05);在第10天至第30天，乳酸菌數(shù)量無明顯變化，維持在107～108cfu·g-1，各組間無顯著性差異(P>0.05)。好氧細(xì)菌在發(fā)酵的第2天和第5天數(shù)量較多，后緩慢下降，第30天，SL+AC添加組好氧細(xì)菌數(shù)量顯著低于對照和SL添加組(P<0.05)。酵母菌和霉菌在發(fā)酵的第2天，AC添加組數(shù)量最多，顯著高于其他組(P<0.05)，以后數(shù)量逐漸減少，在發(fā)酵第30天，SL添加組酵母菌和霉菌數(shù)量顯著高于AC添加組。大腸桿菌數(shù)量在發(fā)酵最初幾天數(shù)量較多，在發(fā)酵第30天，各處理組大腸桿菌數(shù)量從108cfu左右迅速下降為104cfu左右，對照組的大腸桿菌數(shù)量顯著高于其他添加組(P<0.05)。

2.5尖葉胡枝子青貯發(fā)酵品質(zhì) 尖葉胡枝子青貯發(fā)酵品質(zhì)結(jié)果顯示(表5)，與對照相比，添加SL和SL+AC處理的pH值顯著低于對照組(P<0.05)，添加AC處理的pH值也低于對照組，但差異不顯著(P>0.05)；添加SL、AC及SL+AC處理的乳酸含量均顯著增加(P<0.05)；添加AC及SL+AC處理的乙酸含量顯著低于對照組(P<0.05)；添加AC處理的丙酸生成量顯著高于對照及其他處理，SL+AC處理丙酸的生成量最少；對照組的丁酸含量顯著高于其他處理(P<0.05)；添加SL和SL+AC處理的總酸含量顯著高于對照組和添加AC組(P<0.05)；對照組的氨態(tài)氮含量最高，添加SL+AC處理的氨態(tài)氮含量顯著低于SL和AC處理組。

表5 尖葉胡枝子青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)

2.6尖葉胡枝子青貯飼料化學(xué)成分 尖葉胡枝子青貯飼料化學(xué)成分(表6)顯示，各處理組的干物質(zhì)含量無顯著差異(P>0.05)；SL、AC及SL+AC處理的可溶性碳水化合物含量顯著高于對照(P<0.05)；各添加組的中性洗滌纖維含量顯著低于對照組(P<0.05)；添加AC處理的酸性洗滌纖維含量顯著低于對照及其他處理(P<0.05)；添加SL處理的粗蛋白含量與添加AC處理無顯著差異(P>0.05)，但顯著高于對照及SL+AC處理(P<0.05)；SL+AC處理的粗脂肪含量顯著高于對照和其他處理。

2.7青貯品質(zhì)評價 對照組中乙酸占總酸的比例高于50%，表現(xiàn)為乙酸發(fā)酵類型。而添加劑處理組中乳酸占總酸的比例均高于60%，表現(xiàn)為乳酸發(fā)酵類型(表7)。

表6 尖葉胡枝子青貯飼料的化學(xué)成分

根據(jù)弗氏Flieg評分法和各種有機(jī)酸占總酸的比例，對各處理的青貯品質(zhì)進(jìn)行評分(表8)，對照組的青貯品質(zhì)為劣，SL處理組為良，AC處理組和SL+AC處理組得分為優(yōu)。

3 討論

自然環(huán)境下，不同作物上附生的乳酸菌無論從種類上還是數(shù)量上都是不同的，其種類和數(shù)量對青貯的發(fā)酵品質(zhì)有較大的影響。本研究從新鮮的尖葉胡枝子上分離出2株乳酸菌，分別是戊糖片球菌和植物乳桿菌。從這2株菌的生長曲線及產(chǎn)酸速率曲線上看，戊糖片球菌在青貯發(fā)酵初期生長速度及產(chǎn)酸速率優(yōu)于植物乳桿菌，在發(fā)酵中后期植物乳桿菌表現(xiàn)更好。植物乳桿菌產(chǎn)酸能力強(qiáng)、生長速度快，適合作青貯飼料乳酸菌添加劑的菌種。研究表明，青貯飼料發(fā)酵初期，片球菌起著非常重要的作用[21]。實際應(yīng)用情況表明，由于不同乳酸菌菌株在青貯過程中起的作用不同，單獨使用一種菌株有時并不能達(dá)到讓人滿意的青貯效果，乳酸菌青貯添加劑通常都是植物乳桿菌和其他菌種結(jié)合組成的混合物，一般情況下，選用乳酸球菌，乳酸球菌在發(fā)酵初期繁殖旺盛，乳酸桿菌則在發(fā)酵的整個過程中起到了主導(dǎo)作用。

表7 尖葉胡枝子青貯有機(jī)酸占總酸比例

表8 尖葉胡枝子青貯飼料的Flieg評價

青貯原料發(fā)酵開始后，由于各種微生物利用原料中的糖分生長繁殖，數(shù)量較青貯原料上的有較大的增長，在尖葉胡枝子發(fā)酵過程中，添加纖維素酶處理的乳酸菌、好氧細(xì)菌、酵母菌和霉菌、大腸桿菌在發(fā)酵最初都保持較高數(shù)量，這可能與原料用粉碎機(jī)粉碎及纖維素酶可破壞青貯料細(xì)胞壁使其內(nèi)容物流出[22]，為各類微生物生長提供充足底物有關(guān)系。到發(fā)酵后期，由于乳酸菌利用可溶性糖發(fā)酵，降低了pH值，抑制了酵母菌和霉菌、大腸桿菌的生長，其數(shù)量下降很快，同時乳酸菌的數(shù)量也有一定減少。

從試驗結(jié)果看，直接青貯pH值較高，氨態(tài)氮及丁酸生成量較多，乳酸含量少， Flieg青貯飼料評分等級為劣，這可能是由于尖葉胡枝子屬于豆科牧草，緩沖能較高，可溶性碳水化合物含量較少，未能達(dá)到調(diào)制優(yōu)質(zhì)青貯飼料所需要的8%～10%含量[23]，同時原料草表面附著乳酸菌數(shù)量很少，且不良菌種(酵母菌、霉菌和好氧細(xì)菌等)的數(shù)量遠(yuǎn)高于乳酸菌的數(shù)量。本試驗選用的2種添加劑因其主要成分為乳酸菌和纖維素酶，保證了青貯發(fā)酵初期發(fā)酵所需的足夠乳酸菌數(shù)量及可溶性糖含量，并通過乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸降低了pH值，抑制了不良微生物的活動，提高了粗脂肪含量，降低了粗蛋白降解，減少了發(fā)酵過程中營養(yǎng)物質(zhì)的損失，改善了青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)。

4 結(jié)論

從新鮮尖葉胡枝子原料中分離出2株乳酸菌，一株為植物乳桿菌，另一株為戊糖片球菌。在發(fā)酵初期戊糖片球菌產(chǎn)酸速率優(yōu)于植物乳桿菌，在發(fā)酵中后期后者產(chǎn)酸速率優(yōu)于前者。

在尖葉胡枝子青貯過程中，纖維素酶添加組的乳酸菌數(shù)量在貯藏后第2天達(dá)到最大值，其他組在第10天達(dá)到最大值，然后緩慢下降，發(fā)酵第30天，乳酸菌的數(shù)量維持在107cfu左右，好氧細(xì)菌、酵母菌、霉菌及大腸桿菌的數(shù)量也有所減少，大腸桿菌減少更明顯。

添加劑處理組與對照組相比，pH值、氨態(tài)氮及丁酸含量顯著降低(P<0.05)，乳酸含量明顯提高(P<0.05)，發(fā)酵品質(zhì)好于對照，其中添加纖維素酶及乳酸菌和纖維素酶混合添加處理的青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)Flieg等級為優(yōu)。

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