高羊茅雄性不育株花粉母細胞減數分裂染色體行為觀察

付 薇，吳佳海，陳 偉，王小利，牟 瓊

(貴州省草業(yè)研究所，貴州 貴陽 550006)

高羊茅(Festucaarundinacea)是禾本科羊茅屬的一種多年生草本植物，它可用作長期放牧草地的優(yōu)良牧草，經過選育后，高羊茅也是適應性很廣的優(yōu)良草坪草種[1]。貴州省草業(yè)研究所經過多年的田間尋找，于1998年6月在該所試驗駐地發(fā)現了一株高羊茅雄性不育植株，現處于鑒定初期[2]。目前，國內雄性不育系的研究報道多見于作物品種[3-5]，牧草及草坪草雄性不育的研究利用相對較少。國外，法國已把黑麥草(Loliumperenne)的雄性不育系用于生產，加拿大選育出苜蓿(Medicagosativa)雄性不育系20DRE。對三葉草(Trifoliumrepens)、蘇丹草(Sorghumsudanense)的雄性不育也有一些研究[6]，但高羊茅雄性不育系的發(fā)現及利用至今未見報道。

目前，國內對高羊茅的研究主要集中在良種選育[7]、引種適應性[8]、栽培技術[9-10]、愈傷組織培養(yǎng)[11]、分子標記[12]等方面。有關高羊茅細胞學的研究較少，僅見于蔡華等[13]、白宇輝和陳陽莉[14]對高羊茅核型分析報道，而針對雄性不育植株的研究更為鮮見。因此，本試驗以貴州省草業(yè)研究所發(fā)現的高羊茅雄性不育株(編號A072003)為材料，采用卡寶品紅染色制片法，對花粉母細胞減數分裂過程及異常行為進行較為細致的觀察，以期揭示高羊茅不育材料花粉母細胞減數分裂過程中染色體變化的行為規(guī)律，尋找高羊茅花粉敗育的細胞學依據，豐富高羊茅的細胞遺傳學內容，為高羊茅發(fā)育生物學及小孢子敗育等方面提供必要的細胞遺傳學信息，為利用高羊茅雄性不育株開展雜交育種工作，選育一批適用于草坪及飼草兼水保功能的優(yōu)良品種奠定理論基礎，也為高羊茅發(fā)育生物學和育種學提供必要的細胞遺傳學信息。

1 材料與方法

1.1材料 以貴州省草業(yè)研究所獨山基地內種植的高羊茅雄性不育植株(編號A072003)為試材，選取抽穗初期的高羊茅花序進行試驗。

1.2方法 于2011年5月上旬，采用連續(xù)取材觀察的方法于早晨9:00至中午12:30，選取生長健康的高羊茅幼穗，用卡諾氏固定液(無水乙醇∶冰乙酸體積比為3∶1)于室溫下固定3 h后，用95%的乙醇清洗3次，轉入70%乙醇中，4 ℃冰箱保存。采用壓片法制取減數分裂制片。用鑷子夾取花藥，將其置于載玻片上，加1滴卡寶品紅進行染色，然后用鑷子夾破(花粉囊)，擠出花粉母細胞，并盡可能地將其夾碎，去殘渣，染色1～3 min后，加蓋玻片并緊壓，使花粉母細胞進一步分散，用吸水紙吸去多余的染色劑后于日本OLYMPUS公司BH-2型多功能光學顯微鏡下鏡檢，放大倍數為40×10倍，并用Adobe Photoshop 7.0對圖片的亮度和對比度進行優(yōu)化。

2 結果與分析

2.1花粉母細胞減數分裂與花蕾形態(tài)特征相關性 高羊茅每朵小花具有3枚花藥，通過取樣觀察，發(fā)現A072003材料的花粉母細胞的發(fā)育程度與小花大小、花藥長度、花藥顏色緊密相關，處于減數分裂期的小花縱徑為0.05～0.07 cm，花藥長度為0.07～0.18 cm，此間大小的小花能夠觀察到花粉發(fā)育的各個時期(表1)。

2.2高羊茅花粉母細胞減數分裂染色體行為觀察 通過卡諾液固定、 卡寶品紅染色、 壓片及鏡檢等操作，本試驗觀察到了部分高羊茅在減數分裂過程中染色體的一系列行為變化特征。

表1 花粉母細胞減數分裂進程與花器官形態(tài)比較

2.2.1第1次減數分裂 減數分裂的細線期，細胞核內的染色體細長如線，核仁處于核膜附近，在這一時期染色體相互纏繞，密集簇擁到核的一邊(圖1A)。偶線期，細胞核內同源染色體聯(lián)會，染色體開始逐步的分散開，較之于細線期略微變短、增粗，但顏色較淺，顯微鏡下無法辨認染色單體(圖1B)。此時，由于同源染色體的聯(lián)會配對，染色體繼續(xù)螺旋化變短加粗，顏色加深，減數分裂進入粗線期 (圖1C)。雙線期，染色體進一步螺旋化縮短變粗，配對的同源染色體彼此排斥并開始分離，但不完全分開，發(fā)生過交換的部位仍連在一起，形成交叉結，并能觀察棒狀、環(huán)狀和V狀二價體(圖1D)。當減數分裂進行至終變期，染色體超螺旋化，二價體縮至最短，呈現出“紐扣狀”形態(tài)，染色體向核周邊移動，均勻分散排列于細胞核內，核仁變小并逐步消失(圖1E)。中期Ⅰ時，核膜、核仁消失，紡錘體形成，染色體高度凝縮，二價體整齊地聚集在赤道板上，行為特征主要表現為“環(huán)形”和“重疊型”(圖1F)。后期Ⅰ，二價體中的2條同源染色體在紡錘絲的牽引下彼此分開并向兩極移動，此時父母本染色體得以重組 (圖1G)。末期Ⅰ染色體移到兩極后松散變細，逐漸形成2個子核，但細胞質不分裂(圖1H)。

2.2.2第2次減數分裂 高羊茅花粉母細胞在第1次減數分裂完畢之后，細胞核沒有DNA復制，染色質在很短的時間內通過螺旋化縮短、變粗，進入前期Ⅱ時期(圖1I)。到了中期Ⅱ，染色體顯著縮短，每個染色體的著絲點排列在赤道板上面，紡錘絲中部明顯(圖1J)。后期Ⅱ可觀察到著絲粒一分為二，位于赤道板上的姐妹染色單體在各自紡錘絲的牽引下向細胞兩極移動(圖1K)。末期Ⅱ染色體被拉向兩極，紡錘絲消失，核膜、核仁出現，染色體又變細長，形成4個圓形的新核(圖1L)。此時核周圍形成細胞壁，4個子細胞緊密相連發(fā)育成四分體小孢子(圖1M)。四分體初期細胞質濃厚、細胞壁不明顯，以后體積慢慢變大，發(fā)育為成熟游離花粉粒。

2.3高羊茅花粉母細胞減數分裂周期不同步現象 高羊茅花粉母細胞減數分裂過程中，存在著一定程度的非同步性分裂現象，主要表現在，高羊茅同一花序的不同小花內、同一朵小花的不同花藥內，更甚是同一花藥內都存在減數分裂時期不同步的現象，制片中可同時觀察到不同減數分裂時期并存的現象(如：后期Ⅱ、末期Ⅱ、四分體時期并存，末期Ⅰ、前期Ⅱ并存)(圖1N、圖1O)。因此，在高羊茅花粉母細胞減數分裂的同一制片中可觀察到大量2～4個不同時期的分裂相。

圖1 高羊茅花粉母細胞減數分裂過程及分裂不同步性

2.4高羊茅花粉母細胞分裂異常行為 高羊茅雄性不育材料的花粉母細胞減數分裂過程大量存在單價體、染色體橋、落后染色體、微核、不同步分裂等異?，F象，減數分裂產物有三分體(圖2A)，中期Ⅱ可觀察到少量呈60°角的紡錘體(圖2B)。

2.4.1單價體 在減數分裂的終變期，大量花粉母細胞存在因沒有同源染色體而不能聯(lián)會的單價體，這些單價體因不配對常呈棒狀或彎曲成V形而獨立于赤道板之外(圖2C)，有時其自身的兩臂也會配對發(fā)生交叉而成環(huán)狀(圖2D)。

2.4.2染色體橋和片段 在減數分裂中，正常的染色體同倒位染色體之間發(fā)生交叉互換，會使配子染色體上某一區(qū)段缺失或重復，兩條同源染色體無法直線配對，而是以一個圓圈完成同源部分的配對，這個由兩條同源染色體形成的圈被稱作倒位環(huán)。一個倒位雜合體如果著絲粒在倒位環(huán)的外面，則在減數分裂后期會出現“染色體橋”(圖2E)和“片段”(圖2F)的現象，即一條染色單體的兩端都有一個著絲粒，成為跨越兩端的“橋”，同時伴隨一個沒有著絲粒的斷片。染色體橋在染色體移向兩極進入子細胞時被拉斷，造成很大缺失，而染色體斷片則不能進入子細胞的核內，所以由此形成的配子往往是死亡的。

2.4.3落后染色體 花粉母細胞在分裂過程中受到損傷，導致染色體不同步移動或者不移動形成落后染色體，這一異常分裂現象在減數分裂中期Ⅰ，后期Ⅰ，后期Ⅱ和末期Ⅱ都有發(fā)現(圖2G、2H、2I、2J)，減數分裂過程單價體及落后染色體的存在證明了高羊茅雄性不育株的基因組具有較強的雜合性。

2.4.4不同步分裂 高羊茅不育材料中有少數花粉母細胞由于紡錘絲異常，2個子細胞在分裂時不伴隨胞質同步分裂而成，如2個子細胞中，其中一個子細胞的染色體正在紡錘絲牽引下向兩極移動，而另外一個子細胞的染色體已經全部聚集在兩極(圖2K、圖2L)。

2.4.5微核 微核主要是由染色體斷片、落后染色體引起的，發(fā)生斷裂或滯后的染色體不能隨紡錘絲的牽引進入兩極，或滯留于赤道板上，或隨機分布在主核之外，逐漸形成直徑小于主核的圓形或橢圓形微小核，一直到末期Ⅱ再形成微核，這類細胞形成的配子部分不育。該異?，F象在中期Ⅱ、前期Ⅰ、四分體時期比較常見(圖2M，2N，2O)。

3 討論與結論

本試驗中，高羊茅減數分裂進程與小花大小、花藥長度、顏色有密切關系，通過分析花器官形態(tài)特征與減數分裂進程的相關性，并充分利用這種相關性估測減數分裂進程可取得事半功倍的效果。本試驗發(fā)現，高羊茅不育株A072003處于減數分裂期時的小花縱徑為0.05～0.07 cm，花藥長度為0.07～0.18 cm，此間大小的小花能夠觀察到花粉發(fā)育的各個時期。以花藥長度、顏色作為減數分裂進程、花粉粒成熟度的主要判斷依據，比較簡便、直觀。不過，由于高羊茅穗子發(fā)育與播種時間、土壤環(huán)境、氣候條件等密切相關，因此以小花、花藥大小、色澤作為采樣依據，本研究只是一種探索總結，是否適用于其他高羊茅不育材料還有待進一步證實。

試驗中還發(fā)現，高羊茅花粉母細胞減數分裂過程存在著一定程度的非同步性分裂現象，同一花序的不同小花內、同一朵小花的不同花藥內，更甚是同一花藥內都存在減數分裂時期不同步的現象。因此，在高羊茅花粉母細胞減數分裂的同一制片中可觀察到2～4個不同時期的分裂，這一不同步現象在辛培堯等[15]、張偉等[16]、張彩霞等[17]研究中都有報道。王君等[18]在觀察通遼楊(PopulussimoniiCarr×P.nigraL.‘Tongliao’)減數分裂染色體行為過程中也曾指出，各個分裂相的不同步性可以起到延長花期的作用，也有利于增加兩性功能，對種群繁殖后代有利，是植物適應當地環(huán)境條件的一種進化表現。田如霞等[19]在研究錦雞兒(Caraganamicrophylla)花粉母細胞染色體行為中也表明，減數分裂的不同步現象反映出異花授粉植物的同步性比自花授粉植物低的一般規(guī)律。

本研究發(fā)現了染色體橋、片段、落后染色體、微核、不均分離等異?，F象。其中落后染色體的頻率最高，在中期Ⅰ、后期Ⅱ、中期Ⅲ、后期Ⅳ 4個時期中均能發(fā)現，可能是由于某些染色體同源化程度不高導致的。而往往花粉的育性與花粉母細胞減數分裂過程緊密相關，高羊茅雄性不育材料花粉母細胞減數分裂過程中出現了大量的染色體橋和片段，而在分裂后期Ⅰ這些染色單體橋在倒位環(huán)內只有一次交換，涉及2條染色單體產生的配子50%可育，當別的染色體分向兩極時，橋也拉長，一直到拉斷形成染色體斷片為止。這一觀察同何麗霞[20]在黃牡丹(Paeonialutea)花粉母細胞減數分裂過程當中及栗茂騰和蔡和田[21]在披堿草減數分裂中所發(fā)現的現象相似。潘澤惠等[21]在觀察傘形科植物減數分裂時認為，一些種類的染色體發(fā)生雜合性結構差異，致使減數分裂時產生雙著絲點染色體，在后期Ⅰ形成染色體橋和斷片。后期Ⅰ染色體橋是一種不穩(wěn)定結構，在以后的細胞分裂過程中將開始“斷裂-融合一橋”循環(huán)，致使這條染色體從細胞中丟失，結果導致遺傳物質的減少。此外，由于落后染色體和染色體橋造成了染色體的不均勻分配，導致了減數分裂的一些異常結果，形成有遺傳組成不平衡的配子，產生不同遺傳組成的花粉粒。以上都是導致高羊茅花粉敗育的重要原因之一。本研究還在終變期發(fā)現了大量的單價體，有棒狀、V狀、環(huán)狀單價體，這種環(huán)狀單價體在小麥(Triticumaestivum)中已有報道，李萬隆和李振聲[23]指出環(huán)狀單價體的研究對染色體特異性配對等基本理論問題有重要的意義。張正海等[24]在小胡楊(Populussimonii×P.euphratica)染色體行為觀察中指出，小胡楊二分體和三分體的形成是由于中期Ⅱ紡錘體的合并以及減數第2次分裂的不同步所造成的，紡錘體行為影響著減數分裂的胞質分裂，從而導致二分體、三分體等不同構型的減數分裂產物出現。由此分析，本試驗第2次減數分裂過程中觀察到的三分體，可能同中期Ⅱ中發(fā)現的60°角紡錘體有關。三分體、二分體或包含微小孢子的二分體釋放出的小孢子可能將形成未減數分裂花粉，導致敗育。

圖2 高羊茅花粉母細胞減數分裂異?，F象觀察

[1]胡曉艷，呼天明.葦狀羊茅的引種選育研究進展[J].中國種業(yè),2003(12):19-20.

[2]吳佳海，劉正書，牟瓊，等.高羊茅雄性不育系的實現及初步鑒定[J].種子,2001(5):78-80.

[3]李會霞，王玉文，王高鴻，等.谷子雄性不育系雜種優(yōu)勢利用研究[J].甘肅農業(yè)科技,2002(12):8-10.

[4]瞿小旅，彭海峰，劉曉燕，等.高州普通野生稻雄性不育胞質對雜種一代單株產量的影響[J].中國農學通報,2010,26(23):173-176.

[5]李會霞，王玉文，田崗，等.谷子高度雄性不育系不育基因的遺傳分析[J].河北農業(yè)科學,2010,14(11):96-99,104.

[6]李遺民.牧草育種學[M].北京:農業(yè)出版社，1995.

[7]吳佳海，牟瓊，唐成斌，等.牧草新品種黔草1號高羊茅的選育[J].貴州農業(yè)科學,2006,3(4):75-78.

[8]吳佳海，尚以順，牟瓊.高羊茅草坪草在貴州南部地區(qū)的生態(tài)適應性研究[J].草業(yè)科學,2003,20(6):59-61.

[9]吳佳海，唐成斌，牟瓊，等.黔草1號高羊茅新品種的栽培及利用推廣[J].草業(yè)科學,2006,23(4):53-55.

[10]白小明，相斐，羅仁峰，等.多效唑對高羊茅擴展性和根系特性的調控效應[J].草業(yè)科學,2009,26(10):171-176.

[11]王維飛，韓烈保，曾會明.高羊茅愈傷組織誘導及植株再生的研究[J].草業(yè)科學,2006,23(6):99-103.

[12]李惠英，婁燕宏，胡濤，等.中國高羊茅種質資源遺傳多樣性的RAPD分析[J].草業(yè)學報,2010,19(6):208-214.

[13]蔡華，黃正來，喬玉強.六種基因型草坪草的染色體核型分析[J].草業(yè)學報,2006,15(6):109-111.

[14]白宇輝，陳陽莉.三種草坪草的核型研究[J].內江師范學院學報,2006,21(4):58-60.

[15]辛培堯,孫正海,羅思寶,等.大麻花粉母細胞減數分裂染色體行為觀察[J].河南農業(yè)科學，2008,(5):45-48.

[16]張偉，張蜀寧，張紅亮.蘿卜花粉母細胞減數分裂及其雄配子體發(fā)育[J].南京農業(yè)大學學報，2007,30(3):38-41.

[17]張彩霞，明軍，劉春，等.百合花粉母細胞減數分裂異常現象觀測分析[J].生物學通報,2010,45(5):45-48.

[18]王君，康向陽，李代麗，等.通遼楊花粉母細胞減數分裂及其染色體行為研究[J].西北植物學報,2006,26(11):2231-2238.

[19]田如霞，牛西午，崔貴梅，等.小葉錦雞兒花粉母細胞減數分裂染色體行為觀察[J].山西農業(yè)科學,2006,34(2):32-34.

[20]何麗霞.黃牡丹花粉母細胞減數分裂過程的細胞遺傳學觀察[J].蘭州大學學報(自然科學版),2004,40(6):78-40.

[21]栗茂騰，蔡得田.2n雄配子的無融合生殖披堿草減數分裂行為研究[J].遺傳學報,2001,28(10):939-946.

[22]潘澤惠，秦慧貞，吳竹君，等.傘形科植物染色體數目報告[J].植物分類學報,1985,23(2):97-102.

[23]李萬隆，李振聲.普通小麥特殊染色體構型環(huán)狀單價體和類等臂單價的研究[J].武漢植物學研究,1990,8(4):393-395.

[24]張正海，康向陽，劉明虎，等.小胡楊小孢子發(fā)生及微管骨架變化[J].北京林業(yè)大學學報，2008，30(6)：36-40.